肝癌抗原肽冲击转染p53的树突状细胞对荷瘤小鼠免疫功能的影响

 

 

 

【关键词】  癌,肝细胞； 树突状细胞； 癌基因蛋白类； 小鼠

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;   Dendritic cells;   Oncogene proteins;   Mice

【First author’s address】   Department of Infectious Diseases, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan  430060, China

 

树突状细胞（DC）是体内功能最强大的专职性抗原呈递细胞，它们能高效摄取、处理抗原，并将多肽呈递给静息型T细胞，引起针对此抗原的特异性免疫反应[1]。我们将全长野生型p53基因（wt-p53）转染小鼠骨髓来源的DC，然后用肝癌抗原肽修饰已转染野生型p53的DC(wt-p53DC),利用这种DC诱导小鼠脾脏淋巴细胞特异的细胞毒性Ｔ淋巴细胞(CTL)。

一、材料与方法

1. 材料：近交系清洁级615系小鼠购自湖北省医学科学院实验动物繁育中心，5周龄，重量16～20g，雌性。肝癌细胞株H22，胃癌细胞株MNK28购自武汉大学细胞典藏中心，人类野生型p53的真核表达质粒p53ＳＮ３和不含p53的空载体质粒由美国NIH的Nikitina EY教授惠赠。pKnⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶分别购自日本TaKaRa和北京NEB公司。垂直电泳仪和半干电转仪（美国Bio-Rad公司）, 流式细胞仪（瑞士华嘉有限公司）。尼龙毛（日本和光纯药工业株式会社）。3H-TdR上海原子核研究所产品，β液内计数仪（美国Beckman LS 6500）。酶标仪（美国哈希公司）。I-Ab单抗和B7-1、B7-2单抗（美国Pharmingen公司），异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG（美国Santa Cruz公司）。小牛血清（FBS）、抗生物素蛋白-CY3、无血清培养基、RPMI 1640细胞培养液、鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）、鼠白细胞介素4（mIL-4）和脂质体均为美国Sigma公司产品。

2. 肝癌抗原的抽提及含量的测定：取对数生长期肝癌细胞株H22和胃癌细胞株MNK28细胞108个，Hank’s缓冲液冲洗，离心，弃上清液，加入5ml柠檬酸缓冲液（pH＝3.3），吸管吹打，离心，收集上清液，加入3ml 60%乙晴，低压冻干法冻干，加入1ml磷酸缓冲液（PBS），0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存备用，用标准的Bradford蛋白分析法测定抗原蛋白浓度。

3. DC的体外诱导培养：颈椎脱臼处死小鼠，取出其股骨，剪除两端，用PBS冲洗髓腔，低渗破红细胞，Hank’s液洗3次，用含10% FBS的RPMI 1640培养液调细胞浓度为1×106个/ml，6孔板中进行培养（含5μg/L的mGM-CSF和2ng/ml的mIL-4）。第3天细胞换液，并补充mGM-CSF、mIL-4、第6天收获细胞。即成骨髓来源的树突状细胞（BMDC）。

4. 转染BMDC：收集培养4d的BMDC，转入6孔板培养。加入DNA/脂质体，即wt-p53DC组。另设转染空载体组及空白对照组，总体积均为3ml，24h后，补加无血清培养基3ml和细胞因子，继续培养48h。从细胞和培养上清液中提取蛋白，供Western blot检测用。

5. DC的体外修饰：将上述收获的DC和wt-p53DC用含10% FBS的RPMI 1640液调细胞浓度为1×106/ml，24孔板中进行培养（1ml/孔），分别进行PBS、肝癌抗原肽 、胃癌抗原肽等3种刺激物刺激（加入量40μl/孔），24h后收集3种不同修饰的DC，并对3种上清液以及空白对照的DC上清液进行白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素1β（IL-1β）含量的检测，分组如下：单纯DC组：A排：空白对照，B排：肝癌抗原肽，C排：胃癌抗原肽。转染wt-p53DC组：D排：空白对照，E排：肝癌抗原肽，F排：胃癌抗原肽。转染空载DC组：G排：空白对照，H排：肝癌抗原肽，I排：胃癌抗原肽。

6. 流式细胞仪检测BMDC表面分子：收集各组BMDC，分别用I-Ab、B7-1和B7-2单抗孵育，再用Strept Avidin-CY3和羊抗小鼠IgG，4℃避光孵育，洗涤后，重悬各组细胞，待测。

7. Western blot检测蛋白表达：第一抗体是抗人p53单抗, 第二抗体为鼠抗人多克隆抗体。室温孵育1.5h；PBS洗3次，显色。

8. 小鼠脾淋巴细胞激活试验： 取小鼠脾脏，研磨成单个细胞，低渗破红细胞，Hank’s液洗3次，用含10% FBS的RPMI 1640液调细胞浓度为1×107/ml（培养液含终浓度为200U/ml的基因重组人白细胞介素-12），200μl/孔铺于96孔板共6排，加入wt-p53DC和单纯DC、空载组细胞数量为104，48h后，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）对脾淋巴细胞进行激活检测。

9. 肿瘤细胞特异性细胞毒试验：将H22修饰的wt-p53DC和单纯DC激活增殖的淋巴细胞在24孔板中传代培养7d，收获后作为效应细胞，分别以肝癌细胞和胃癌细胞作为靶细胞，按效∶靶=20∶1的比例混合，37℃温浴28h，然后采用MTT法检测杀伤率。按下列公式计算特异性杀伤率：特异性细胞杀伤率（%）=[1-（效靶吸光度-效应细胞吸光度）/靶细胞吸光度]×100%。

二、结果

1. 肿瘤抗原含量的测定及Western blot检测p53蛋白表达结果：108个细胞含有80～100μｇ抗原。转染小鼠p53 cDNA的BMDC及其培养上清中均可以检测到p53表达；而转染空载体和空白对照的BMDC及其培养上清液中均未能检测到p53存在，见图1。

2. 体外修饰的wt-p53DC细胞因子的表达：两种抗原肽通过对肽的提呈，可使DC和wt-p53DC成熟，上清液IL-12、TNFα、IL-1β 3种细胞因子含量明显增加。肝癌与胃癌抗原肽冲击的wt-p53DC分泌的3种细胞因子含量明显增高, 与空白对照组及单纯DC组比较，F值分别为7.58、9.36、10.47，P值均<0.05。而肝癌抗原肽冲击的wt-p53DC分泌的3种细胞因子明显高于胃癌抗原肽冲击组, t值分别为2.66、2.83、3.01，P值均<0.05,见表1。

3. wt-p53DC和单纯DC刺激小鼠T细胞增殖能力的检测：混合淋巴细胞反应结果显示，肝癌抗原肽修饰的wt-p53DC刺激小鼠脾脏T细胞增殖水平明显高于未修饰的wt-p53DC组及空白DC对照组，t值分别为5.41、4.88，P值均<0.01，见表2。

表2  肝癌抗原肽修饰的wt-p53树突状细胞激发小鼠

T细胞增殖功能（n＝12，x-±s）

组别                  每分钟记数（cpm） 刺激指数（SI）

DC                    4349.0±  783.1* 1.29±0.55

wt-p53DC              4394.7±  739.5* 1.30±0.69

wt-p53DC（肝癌抗原肽修饰）        13906.0±4079.7   4.69±1.59

  注：DC：树突状细胞；* 与肝癌抗原肽修饰的wt-p53DC组比较，P<0.01

4. 修饰的DC表型的变化：DC经不同因素修饰后,采用FACSort分析DC膜表面这4种分子,经流式细胞仪检测转染wt-p53加肝癌抗原肽冲击的DC表面均高表达B7-1、B7-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，分别为88.2%、85%、84.5%、82.1%；而其他DC修饰组呈低表达，F值分别为12.12、10.53、10.84、9.62，P值均＜0.05，见表3。

5. DC激活增殖的淋巴细胞的细胞毒功能：脾淋巴细胞经肝癌抗原肽冲击的wt-p53DC刺激后，活化增殖，能够特异性地杀伤肝癌细胞，杀伤率为81.6%±2.4%，而胃癌抗原肽冲击的wt-p53DC及未冲击的wt-p53DC对癌细胞的杀伤率仅为45.8%±2.1%、23.5%±1.8%，与肝癌抗原肽冲击组比较t值分别为2.45、3.14，P值均<0.05。

三、讨论

利用DC来诱导机体抗肿瘤免疫已成为肿瘤免疫治疗的一种新途径[2]。肿瘤细胞自身提呈抗原效率非常低下，原因在于肿瘤细胞组织相容性复合物（MHC）-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子以及共刺激分子缺乏或呈低表达，因此，体内针对肿瘤细胞的免疫功能低下。

肿瘤细胞中外源性p53基因的表达会增强其免疫原性,从而激发了患者自身的抗肿瘤免疫功能。DC作为一种专职提呈细胞，其核心问题是体外如何对DC进行肿瘤抗原肽的特异性修饰，特异性修饰则是从基因转染和大分子量抗原冲击的角度进行，Ohshita等[3]研究发现细胞体内基因转染和抗原肽体外冲击可以很好地联合修饰DC，可达到特异性修饰的目的。

肿瘤细胞内含有大量的蛋白降解产物(肽)，其中一部分肽具有肿瘤细胞特异性，可与瘤细胞内MHC分子结合，并表达在细胞表面，成为免疫细胞识别的靶子，因而被称为肿瘤抗原肽。诱发机体肿瘤特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞反应的并不是完整的蛋白质分子，而是抗原肽[4]；导入目的基因的DC，体外能明显刺激其分泌细胞因子，并提高自体CTL的杀瘤细胞能力；也可促进其他多种细胞因子的分泌，如IL-β、IL-6、IL-8、IL-12、TNFα等，因此，对DC进行胞内外联合修饰，包括对肿瘤细胞进行相应的抗原肽冲击，能提供更有效的可供抗原识别的表位,转染的基因能长久的表达,不受人类白细胞抗原限制,因而达到改善机体的免疫功能的目的[5]。

Midgley等[6]认为：p53错义突变在肿瘤细胞中的一个结果是使p53蛋白表达增加，用野生型p53免疫过的小鼠会保护其免遭来自后来的表达突变型p53的肿瘤细胞的侵袭。由野生型p53获得的抗原决定簇和作为潜在的免疫原性由DC提呈经MHC-Ⅱ类途径刺激肿瘤患者的T细胞将引起特异性CTL反应。两种抗原肽均可以通过对wt-p53DC的冲击，使细胞因子含量明显增加。

进展期肝癌一重要的生物学特征就是肿瘤细胞内的过表达p53，我们用wt-p53,它与大多数肿瘤中整个p53分子的过表达均相关，因此,转染wt-p53的DC对过表达p53的肿瘤可产生特异的免疫反应。

肝癌组的细胞因子含量明显高于胃癌组。这表明肝癌过表达p53生物学特征比胃癌强。

本实验中我们先将wt-p53导入脂质体内并转染DC，然后用肝癌抗原肽冲击wt-p53DC, 即：基因转染+抗原肽联合修饰DC诱导小鼠CTL，结果表明：肝癌抗原肽冲击的wt-p53DC的IL-12、TNFα、IL-1β 3种细胞因子含量明显增加，分别为（512.6±95.2）ng/L、（537.2±14.3）ng/L、（541.1±12.1）ng/L；其刺激小鼠脾脏T细胞增殖水平明显高于对照组；该细胞高表达B7-1、B7-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ；能够提高杀伤肝癌细胞的杀伤率，因此，用这种联合修饰的ＤＣ能提高Ｔ淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用。

参  考  文  献

1Burgdorf SK, Claesson MH, Rosenberg J. Dendritic cell-based cancer vaccine.Ugeskr Laeger, 2006, 168: 1420-1423.

2Lesterhuis WJ, de Vries IJ, Schuurhuis DH, et al. Vaccination of colorectal cancer patients with CEA-loaded dendritic cells: antigen-specific T cell responses in DTH skin tests. Ann Oncol, 2006, 17: 974-980.

3Ohshita A, Yamaguchi Y, Minami K, et al. Generation of tumor-reactive effector lymphocytes using tumor RNA-introduced dendritic cells in gastric cancer patients. Int J Oncol, 2006, 28:1163-1171.

4Delgado M, Gonzalez-Rey E, Ganea D. The neuropeptide vasoactive intestinal peptide generates tolerogenic dendritic cells. J Immunol, 2005, 175: 7311-7324.

5Suto T, Habano W, Sugai T, et al. Aberrations of the K-ras, p53, and APC genes in extrahepatic bile duct cancer. J Surg Oncol, 2000, 73: 158-163.

6Midgley CA, Desterro JM, Saville MK, et al. An N-terminal p14ARF peptide blocks Mdm2-dependent ubiquitination in vitro and can activate p53 in vivo. Oncogene, 2000, 19: 2312-2323.