血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞基因表达的影响

 

 

【摘要】  目的  观察血管紧张素Ⅱ对培养肝星状细胞（HSC）株LX2细胞基因表达的影响。 方法  以1×10-5mol/L的血管紧张素Ⅱ与LX2细胞孵育48h，对照组不加血管紧张素Ⅱ。收集实验组和对照组细胞，分别提取mRNA及总蛋白质，进行抑制性消减杂交和蛋白质双向电泳及质谱分析。 结果  抑制性消减杂交产物经两轮聚合酶链反应（PCR）扩增，结果显示为200～1000bp大小不等的插入片段，挑选36个克隆测序，应用生物信息学技术分析，发现13个克隆与未知基因序列高度同源，其中GenBank号为 BC097361、BC057380的基因为具有开放读码框架的完整基因。其余23个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(98%～100%)，主要相关基因包括β肌动蛋白、亮氨酰tRNA合成酶、基础免疫球蛋白2、丙酮酸激酶、过氧化物酶1、人类白细胞抗原-B关联转录物3等。在血管紧张素Ⅱ孵育的和阴性对照HSC的双向电泳图谱中分别探测到1110、1008个点，两个图谱有504个点匹配。其中108个点和对照相比明显上调（容积比>1.5），153个点和对照相比明显下调（容积比<0.67），选取其中相对容积上调的10对点进行质谱分析，其中8个点在数据库中检索得到相应结果，分别为抑素、电子转移黄素蛋白亚单位、超氧化物歧化酶2、三磷酸核苷酶等。 结论  血管紧张素Ⅱ处理后的HSC mRNA表达上调具有增殖加速、凋亡抑制和促进分化等生物学作用，部分上调蛋白质为细胞内信号传导蛋白质、代谢调控蛋白质、细胞凋亡抑制蛋白质以及纤维化相关调控蛋白质。

【关键词】  血管紧张素Ⅱ； 肝星状细胞； 蛋白质组； 基因

 

【Abstract】    Objective    Our previous investigation demonstrated that angiotensin II could induce proliferation and differentiation of hepatic stellate cells, and also could up-regulate its extracellular matrix synthesis. The objective of this study was to determine the effects of 10-5 mol/L angiotensin II on gene expression of hepatic stellate cells.  Methods    After incubation with 10-5 mol/L angiotensin II for 48 hours, the cultured hepatic stellate cells were collected. The mRNA and total protein were obtained from cell lysate and then suppression subtractive hybridization (SSH), 2D-gel electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry were used to identify these cDNAs and proteins. Results    A total of 36 clones from the subtracted cDNA library were sequenced and compared to sequences in the GenBank using BLAST. Of the 36 differentially expressed gene fragments from the subtracted library, 13 differentially expressed gene fragments showed significant homology to other known proteins, such as ribosomal protein, β-actin FE-3, leucyl-tRNA synthetase, CD147, pyruvate kinase, peroxiredoxin 1, and BAT3, while 2 other gene fragments encoding protein BC097361 and BC057380 and their functions were not disclosed. About 1110 and 1008 protein spots were detected by employing the ImageMaster 2D Platinum 4.9 proteome image analysis system in angiotensin-treated hepatic stellate cells and control cells separately. Among these spots 108 proteins were up-regulated while the other 153 proteins were down-regulated. Several up-regulated proteins were chosen to be excised and in-gel digest MALDI-TOF-MS and Database analysis showed that among the high expression proteins, there were prohibitin, RBL-NDP kinase 1.8× 104 subunit, electron transfer flavoprotein alpha-subunit, guanine nucleotide binding protein, alpha 15, and heat shock 7.0× 104 protein 5. Conclusion    Our results suggest that the up-regulation of hepatic stellate cell mRNA influences proliferation, differentiation and apoptosis of those cells. The proteins of signal transduction, metabolizing regulation, apoptosis suppression, and fibrogenesis regulation of hepatic stelllate cells were up-regulated.

【Key words】     Angiotensin II;  Hepatic stellate cell;   Proteome;   Gene

肝纤维化的发生是以肝星状细胞（HSC）激活、增殖以及过量表达细胞外基质为特征的病理过程。我们的研究证实肝组织局部肾素-血管紧张素系统激活与肝纤维化发生有关，激活后的HSC表达血管紧张素受体1，并证实血管紧张素Ⅱ可以促进HSC增殖和细胞外基质的表达[1, 2]，但这一过程的生物学机制尚不明确。我们应用抑制性消减杂交及蛋白质组学技术，以期从mRNA及蛋白质水平明确血管紧张素受体1激活后HSC基因表达的变化。

材料与方法

1. 细胞与主要试剂：HSC细胞株LX2由徐列明教授惠赠。重组血管紧张素Ⅱ购自美国Sigma公司，mRNA抽提试剂盒购自美国Pharmacia公司，聚合酶链反应（PCR）-Select cDNA Subtraction试剂盒、50×PCR酶混合物及Advantage PCR Cloning试剂盒均购自日本Clontech公司，PCR产物纯化试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体购自美国Promega公司。DNA序列测序由上海生工生物工程公司完成。固相pH梯度缓冲液、载体两性电解质、Pharmalyte、等电聚焦胶条（pH3～10 24cm）均购自美国Pharmacia公司。宽范围蛋白质分子量标准、DNA酶I、RNA酶A购自美国Progema公司，蛋白酶抑制剂购自美国Calbiochem公司。

2. 主要仪器：美国ABI公司的9700PCR仪，美国Pharmacia公司的Ettan IPGphor Ⅱ等电聚焦系统、Ettan DALTsix垂直电泳系统、GeneQuant定量系统、ImageMaster 2D Platinum4.9凝胶分析系统，美国Beckman Coulter公司的J30低温超速离心机，中国台湾Umax公司的Powerlook Ⅲ凝胶扫描仪。美国Milipore公司的Amicon Ultra-4超滤离心管。

3. 血管紧张素Ⅱ作用及细胞mRNA、总蛋白质的提取：根据本实验室细胞增殖实验结果（四甲基偶氮唑盐法），选取1×10-5mol/L的血管紧张素Ⅱ作用接种于25cm2培养瓶的LX2细胞，设只加入溶剂的细胞为对照，作用48h，0.1%乙二胺四乙酸钠消化、收集细胞。提取血管紧张素Ⅱ作用的及对照LX2细胞mRNA，做mRNA定性、定量分析。按2×106细胞加入150μl裂解液（8mol/L尿素、4%３-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]丙磺酸内盐、40mmol/L Tris、1%二硫苏糖醇、2%载体两性电解质、0.1%蛋白酶抑制剂）剧烈震荡10min；加入0.1mg/ml DNA酶I、0.025mg/ml RNA酶A，4℃ 15000r/min离心15min；收集上清液，用裂解液稀释10倍，以4℃ 6400r/min超滤离心除盐4h，两组蛋白质样品终体积均为250μl，取少量样品进行Bradford法定量。

4. 消减杂交文库的建立：用PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒中的试剂，以获得的mRNA为模板逆转录合成cDNA。按试剂盒说明书进行：血管紧张素Ⅱ作用的及对照LX2细胞cDNA分别标记为测试和驱动，经RsaⅠ消化，产生相对较短的平端片段，纯化酶切产物。将测试cDNA分为两份，分别连接试剂盒提供的寡核苷酸接头1和接头2R，与过量驱动cDNA进行杂交；合并两种杂交产物再与驱动cDNA做第2轮杂交；将杂交产物做选择性PCR扩增，使测试cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。

5. 克隆鉴定分析：扩增产物与pGEM-Teasy载体连接，转化DH5α感受态细菌，在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上，37℃培养18h；挑取白色菌落，增菌，以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增，证明含有插入片段（200～1000bp）后，测序。应用生物信息学将测得序列与GenBank中数据进行同源性分析。

6. 上样、胶条重泡涨与第一向固相pH梯度等电聚焦：调整样品浓度与体积，使血管紧张素Ⅱ作用的LX2细胞及对照细胞蛋白质样品的上样体积与上样量为200μl、0.8mg，样品中加入重泡涨液（8mol/L尿素、4% 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]丙磺酸内盐、8mol/L 二硫苏糖醇、0.5%固相pH梯度缓冲液pH3～10，痕量溴酚蓝）充分混合，总体积450μl，加入泡涨盘；将24cm等电聚焦胶条置入盘中，重泡涨16h，胶条置于Ettan IPGphor Ⅱ等电聚焦仪中，20℃聚焦，总电压时间积为57980Vh。

7. 第二向垂直板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳：等电聚焦结束后，胶条分别于20ml平衡液A（50mmol/L Tris、6mol/L尿素、30%甘油、1%十二烷基硫酸钠、0.2%二硫苏糖醇、痕量溴酚蓝）和20ml平衡液B（50mmol/L Tris、6mol/L尿素、30%甘油、1%十二烷基硫酸钠、3%碘乙酰胺、痕量溴酚蓝）中各15min，将胶条移至12.5%凝胶上，在其一端的外侧加蛋白质分子量标准，10g/L琼脂糖封闭，10℃循环水冷却，每块胶2.5W电泳30min，再每块胶50W电泳4h。

8. 凝胶考马斯亮蓝染色：将两块凝胶分别置于500ml考马斯亮蓝染液中（0.1%考马斯亮蓝R-250、40%甲醇、10%乙酸）染色2h，将凝胶置于500ml脱色液中（10%甲醇、10%乙酸）脱色，脱色至凝胶背景清楚。

9. 凝胶图像获取与分析：凝胶扫描仪以一致的扫描参数获取2张凝胶图像，用ImageMaster 2D Platinum4.9凝胶分析系统对图像进行背景消减、斑点检测、匹配，获取斑点、坐标表观等电点、分子量等。

10. 差异蛋白质点肽质量指纹分析：结合软件分析结果与直接观察选取10个蛋白质点，手工切点，样品送北京华大蛋白质研究开发中心以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行肽质量指纹分析。

结    果

1. RNA定性、定量分析：血管紧张素Ⅱ作用的及对照LX2细胞mRNA分别为4.76μg和7.76μg，A260/A280分别为1.97和1.94。10g/L琼脂糖凝胶电泳见mRNA为大于0.5kb清晰慧尾片状条带。

2. cDNA两端连接效率检测：cDNA与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败的最关键步骤。将连接有接头1和接头2R的两组cDNA分别用不同的特异性引物［看家基因（3-磷酸甘油醛脱氢酶）］进行28个循环扩增，产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示两组cDNA扩增产物浓度相当，说明cDNA已与接头高效率连接。

3. cDNA消减文库消减效率的鉴定：分别以消减及未消减PCR产物为模板，用3-磷酸甘油醛脱氢酶引物进行PCR扩增，分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5μl进行电泳鉴定。结果显示：与未消减组PCR产物相比，消减组PCR产物中3-磷酸甘油醛脱氢酶引物基因产物大大减少，说明所构建的消减文库具有很高的消减效率，见图1。

4. 差异表达cDNA片段的扩增及克隆：杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200～1000bp大小不等的插入片段，所获得克隆几乎均含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段，见图2。

5. cDNA测序与同源性分析结果：挑选36个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较。应用生物信息学技术分析发现，其中13个克隆与未知基因序列高度同源（表1），其中GenBank号为BC097361、BC057380的基因为具有开放读码框架的完整基因。其余23个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(98%～100%)，见表2。

表1  阳性克隆插入片段与GenBank未知功能基因

同源序列比较结果

GenBank登陆号      相同克隆数      同源性（%）

  AK155563              5          98～100

  AC131065              1          98

  BC032050              4          99～100

  BC057380*             2          99～100

  BC097361*             1          99

  注：* 已公布开放读码框架

表2 阳性克隆插入片段与GenBank已知功能基因

同源序列比较结果

已知的同源序列编码蛋白质 相同克隆数 同源性（%）

核糖体蛋白 L8                1      100

核糖体蛋白 S28               1      100

核糖体蛋白 L41               1      100

核糖体蛋白 L27               1      99

β肌动蛋白                   2      98～100

亮氨酰tRNA合成酶             4      100

基础免疫球蛋白2              3      100

层黏连蛋白α5                2      100

CDC42蛋白激酶α              2      99

Lemd2蛋白                    2      99

丙酮酸激酶                   1      100

过氧化物酶1                  1      99

组蛋白H3                     1      99

人类白细胞抗原-B关联转录物3  1      100

6. 血管紧张素Ⅱ作用LX2细胞与对照LX2细胞双向电泳图谱：Powerlook Ⅲ采集到的血管紧张素Ⅱ作用的和对照组细胞总蛋白质二维电泳图谱，经Imagemaster 2D platinum 4.9软件分析分别获得了1110和1008个点，以等电点4～8和分子量为2.5×104～10.0×104范围的蛋白质斑点分布最多，见图3。

7. 血管紧张素Ⅱ作用LX2细胞与对照LX2细胞双向电泳图谱中蛋白质点的差异分析：经Imagemaster 2D platinum 4.9软件匹配，2张电泳图谱有504个蛋白质点匹配，其中108个蛋白质点和对照相比明显上调（容积比>1.5），153个蛋白质点和对照相比明显下调（容积比<0.67）；结合肉眼观察选取其中相对容积上调的10对点（图3）进一步分析，见表3。

8. 差异蛋白质点的肽质指纹分析：对所选10个上调的蛋白质点酶切，以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行肽质指纹图检测，并以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，共得到9个肽质量指纹图，其中蛋白质点6694测定结果见图4，蛋白质点7623未检测出样品峰值。对所获得的肽质量指纹图用Matrixscience中的Mascot查询软件搜索NCBInr数据库，搜索结果见表4；再结合双向凝胶电泳相应点的表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率（>l5%）等进行综合分析，蛋白质点6694检索到匹配数据的结果见表5。

讨    论

HSC是肝纤维化发生过程中细胞外基质的主要来源细胞。我们曾证实激活的HSC表达血管紧张素受体1，组织局部肾素-血管紧张素系统激活与肝纤维化发生有关，该观点已经逐步为国外同道相关研究所证实[3]。有研究显示联合应用血管紧张素转换酶抑制剂对丙型肝炎肝纤维化具有良好的改善作用[4]。但血管紧张素受体1激活后如何上调细胞外基质表达的机制仍然不明确。抑制性消减杂交和差异蛋白质组技术都是筛选差异表达基因的重要手段，两者所面对的研究水平不同，各有局限，我们结合两种技术对同一时点下血管紧张素Ⅱ作用的HSC基因表达进行了mRNA和蛋白质水平分析，这有助于更加全面掌握这种基因表达的变化。

对人HSC在血管紧张素Ⅱ干预后的基因表达差异分析，结果显示上调基因功能已知的分为：（1）细胞合成代谢：核糖体蛋白、亮氨酰tRNA合成酶都是机体内蛋白质合成过程的重要组成部分[5]，丙酮酸激酶是细胞内糖代谢的限速酶[6]，提示血管紧张素Ⅱ能够上调HSC的蛋白质合成及促进其能量代谢。（2）促细胞增殖：基质金属蛋白酶会在细胞增殖时上调以降解细胞外基质拓展细胞增殖时所需要的空间，并降低细胞的黏附[7]。基础免疫球蛋白2与诱导基质金属蛋白酶表达相关[8]，提示血管紧张素Ⅱ能促进HSC增殖。（3）细胞周期相关：CDC42能够决定细胞形态，并调节细胞周期进程[9]。（4）抗过氧化：过氧化物酶1能够还原多种羟过氧化物使DNA、胞膜、蛋白质等免于过氧化损伤[10]。（5）抑制凋亡：有研究显示人类白细胞抗原-B关联转录物3是胱冬肽酶-3的底物，其上调可在功能上抑制胱冬肽酶-3在细胞凋亡中的作用[11]。（6）HSC活化：肝纤维化发生时HSC的重要变化就是从星状形态分化至肌样成纤维细胞，从而获得成纤维细胞的功能[12]；组蛋白H3在细胞分化时上调[13]，活化的HSC能大量表达β肌动蛋白[14]，这些都进一步证明了血管紧张素Ⅱ能够进一步促进肝星状细胞分化。

本研究中我们随机选取了部分在血管紧张素Ⅱ作用的HSC中上调的蛋白质进行肽质量指纹分析，结果显示：（1）细胞信号传导：本研究结果显示血管紧张素Ⅱ作用后HSC三磷酸核苷酶1.8×104亚单位和G蛋白α15亚单位上调，三磷酸核苷酶能使二磷酸核苷磷酸化，同时也是一种蛋白激酶，对细胞内信号传导及细胞迁移具有重要意义；G蛋白是细胞膜受体信号向胞内传导的重要通道[15]。这两个蛋白质的上调提示血管紧张素Ⅱ能够活化某种G蛋白偶联受体。（2）生物氧化、能量代谢：黄素蛋白和线粒体钙依赖溶质载体是细胞生物氧化、能量代谢过程重要参与者[16]，本研究中血管紧张素Ⅱ作用后使HSC这两种蛋白质表达上调，提示血管紧张素Ⅱ刺激HSC功能活化后，细胞的耗能增加、代谢水平升高。超氧化物歧化酶2是重要抗氧化剂，其表达上调能够有利于清除细胞代谢水平升高后产生的大量过氧化物[17]。（3）细胞凋亡：抑素同细胞周期、衰老、凋亡以及线粒体稳定等密切相关[18]，目前认为抑素可能参与了肾间质纤维化发生，在肾间质纤维化发生过程中，肾组织抑素的表达存在动态变化，提示抑素可能参与了这个过程，我们发现血管紧张素Ⅱ作用HSC 48h后抑素上调，提示肝纤维化的过程中也可能有抑素参与。7.0×104热休克蛋白是一种分子伴侣能够保护蛋白质结构、参与细胞内蛋白质转运，使细胞免于应激损伤[19]，Saile等[20]研究发现7.0×104热休克蛋白能够抑制干扰素γ引起的HSC凋亡，本研究结果中7.0×104热休克蛋白A5上调，提示经血管紧张素Ⅱ作用后HSC抗应激损伤能力增强。

虽然两种方法筛选到的差异表达基因并不完全相同，但从这些基因的功能上看都具有相似之处：活化血管紧张素受体1激活HSC，使细胞代谢水平升高，抑制细胞凋亡信号的传导，从而促进HSC增殖及分化。本研究初步揭示了在血管紧张素Ⅱ作用下HSC基因表达的变化，对于以上结果的进一步鉴定工作正在进行中。

参  考  文  献

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