大鼠肝纤维化病理过程中Smads锚着蛋白表达变化

 

 

 

【摘要】  目的  观察肝纤维化病理过程中肝脏Smads锚着蛋白（SARA）的表达变化及其与肝纤维化的关系。 方法  大鼠每kg体重10μl二甲基亚硝胺腹腔注射，1次/d，每周连续3d，共4周，复制大鼠肝纤维化模型。模型大鼠分别设首次造模后1、3d、1、2、3、4周末，与造模停止后1、2、4周，共9个时间段为观察组。每组5～8只，另设正常大鼠10只为对照组。天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积，盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量，免疫组织化学染色观察肝组织SARA蛋白表达，Western blot法分析肝组织转化生长因子（TGF）β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和SARA蛋白的表达，并进行以上指标的相关性分析。 结果  随二甲基亚硝胺染毒持续，模型大鼠肝脏胶原增生(Hyp含量)与沉积增加，4周末时达到高峰，可见宽大纤维间隔与假小叶；而后随染毒停止，肝脏胶原沉积与纤维间隔有所减轻。模型组4、5、6、8周肝组织Hyp平均含量(μg/g)分别为193.0±39.2、188.5±39.9、174.4±21.2、163.6±31.5，对照组分别为125.6±19.5，t值在3.43～4.9，P值均＜0.01。免疫组织化学染色发现，SARA主要表达于正常与纤维化肝脏的肝窦周围间质细胞，随肝纤维化发展SARA阳性染色细胞数量减少；随染毒停止与肝纤维化恢复，SARA渐恢复至正常组水平。Western blot发现，随肝纤维化形成，模型大鼠肝组织TGFβ1、α-SMA蛋白表达逐渐增加，而SARA蛋白表达逐渐减少；肝纤维化恢复过程中，SARA渐恢复接近正常水平，TGFβ1与α-SMA蛋白表达有所下降。在肝纤维化形成与恢复过程中，SARA蛋白与Hyp含量、TGFβ1与α-SMA表达均呈明显负相关。 结论  SARA蛋白主要表达于肝脏间质细胞；随大鼠肝纤维化发展，SARA表达减少；SARA蛋白与肝纤维化形成呈负相关关系。

【关键词】  肝纤维化;  转化生长因子β； Smads锚着蛋白

 

【Abstract】    Objective    To investigate the dynamic characteristics of Smad anchor for receptor activation (SARA) expression during liver fibrogenesis in rats and the relationship between SARA and liver fibrosis. Methods    Liver fibrosis was induced in 74 rats by intraperitoneal injection of dimethylnitrosamine (DMN) with a dosage of 10μl/kg body weight, once a day, 3 days per week for 4 weeks.  The model rats were randomly divided into 9 groups for studying the changes: 1 d, 3 ds, 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after starting the ip injections (intoxicating phase), and 1 week, 2 weeks and 4 weeks after stopping the injections (5th w, 7th w and 8th w, recovery phase). Each group included 5-8 rats. In addition, 10 non-treated rats served as normal controls. The rat liver tissues were examined. Collagen deposition was stained with Sirius red, and hydroxyproline (Hyp) was measured with Jamall’ method. SARA spatial expression in the livers was detected by immunohistochemistry, and the expressions of TGFβ1, α-SMA and SARA protein were detected by Western blot. The relationships of SARA with Hyp, TGFβ1 and α-SMA were analyzed. Results    During the intoxicating phase, the rat hepatic collagen production (Hyp content) and deposition increased as DMN intoxication continued, and there was marked fibrous septum and pseudo-lobule formation at the end of the 4th w.  During the recovery phase, the rat hepatic collagen deposition and fibrous septum formation were lessened, but the Hyp content in the livers of the model rats at the end of 4th w, 5th w, 6th w and 8th w was still higher than that of the controls (193.04±39.15, 188.49±39.92, 174.39±21.22, 163.59±31.47 vs 125.64±19.51; t from 3.43 to 4.9, P < 0.01). SARA was mainly stained positively in interstitial cells surrounding the hepatic sinusoids in both normal and fibrotic livers, and the number of the positive stained cells decreased as liver fibrosis developed, and gradually returned to normal after stopping the intoxication. The expressions of TGFβ1 and α-SMA were gradually increased, as shown with Western blot, but SARA decreased as liver fibrosis developed. The expressions of TGFβ1 and α-SMA were slightly decreased, SARA expression recovered to the normal level after stopping the DMN intoxication. During liver fibrosis developing and recovery phases, SARA was significantly negatively correlated with TGFβ1 and α-SMA expressions and Hyp contents. Conclusions    SARA was mainly expressed in the liver interstitial cells, and it was negatively correlated with liver fibrosis formation.

【Key words】     Liver fibrosis;   Transforming growth factor beta;   Smad anchor for receptor activation

转化生长因子（TGF）β1是重要的促肝纤维化生长因子[1]，近年研究表明，TGFβ受体（TGFβ receptor, ＴβR）/Smads是其主要信号转导通路[2]，TGFβ1通过ＴβR信号跨膜，激活胞内Smads蛋白并使之转位细胞核内，从而发挥其生物效应。Smads锚着蛋白（smads anchor for receptor activation, SARA），可分别连接跨膜的Ⅰ型TGFβ受体（TGFβ receptor type Ⅰ, ＴβR-Ⅰ)与胞内Smads蛋白，在TGFβ受体/Smads信号转导通路中发挥重要作用。既往我们发现，体外培养的原代肝星状细胞（HSC）随活化程度增强，SARA蛋白表达明显减少[3]。但是，肝纤维化过程中肝脏SARA蛋白有何变化特点？其功能作用如何？本研究通过动态观察大鼠肝纤维化形成与恢复过程中肝组织SARA蛋白的表达水平与组织部位，并分析SARA蛋白与肝纤维化病理形成的关系。

材料与方法

1. 动物与主要试剂、抗体：Wistar雄性大鼠74只，清洁级，体重（150±10）g，中国科学院上海实验动物中心提供。二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN），购自日本东京化成工业株式会社。羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）标准品，分析纯，日本ナカラィテスヶ株式会社产品。小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体，美国DAKO公司。小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体，美国Sigma公司。兔抗人SARA蛋白多克隆抗体，美国Santa Cruz公司。兔抗人TGFβ1多克隆抗体，美国R&D公司。辣根过氧化物酶标记驴抗兔抗体和辣根过氧化物酶标记驴抗鼠抗体, 美国Amersham Pharmacia Biotech公司。

2. 模型制备与分组：模型制备：以大鼠每千克体重10μl DMN腹腔注射，1次/d，每周连续3d，共4周；尔后停止染毒，继续常规喂养至8周末。模型组大鼠64只，分别设首次染毒后1、3d、1、2、3、4周末，与染毒停止后1、2、4周，共9个时间段为观察组。每组5～8只。各组大鼠分别于以上观察时间结束时处死。另设正常大鼠10只为对照组，等剂量等渗盐水腹腔注射，分别于1d、4周和8周末时处死。

3. 肝组织Hyp测定：采用Jamall氏法，即称取100mg湿肝，加入2.5ml蒸馏水，4℃匀浆。取100μl肝组织匀浆液测定总蛋白；其余部分与等体积12mol/L盐酸105℃水解18h，过滤，取水解液100μl 40℃烘干。分别取Hyp标准溶液（0.01g/L）20～160μl，设为反应标准管。每个样品与标准管设2复管，经加氯氨－T溶液、欧氏液［为250g/L对二甲基氨基甲苯、273ml/L高氯酸的异丙醇溶液］反应，50℃，90min水浴后，分光光度仪558 nm处测定吸光度（A）值。计算标准曲线回归方程，以此计算样品含量，并以匀浆液的总蛋白量校正，肝组织总蛋白中Hyp含量以“μg/g”表示。

4. 肝组织α-SMA、TGFβ1和SARA蛋白表达：Western blot。取100mg肝组织置于1 ml 组织裂解液（20mmol/L 氯化钠, 1% Nonidet P40, 0.1%十二烷基硫酸钠, 50mmol/L 三氨基甲烷, 5mmol/L 乙二胺四乙酸, 1mmol/L苯甲基磺酰氟，1×康哌立特）中裂解蛋白质，测定裂解液总蛋白含量。取30μg总蛋白含量的裂解液进行10%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳。经硝酸纤维素膜转移。5%脱脂奶粉封闭，分别与特异性α-SMA、TGFβ1和SARA抗体（浓度均为1∶200）孵育，洗涤，再以辣根过氧化物酶偶联的第二抗体作用，反应信号经化学荧光底物 (美国Pierce公司)发光，X线胶片曝光。并以计算机图像扫描图像分析，测定灰度值，代表蛋白的表达量。以同一张蛋白印迹膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸钠洗脱抗体，再以β-actin孵育杂交，作为内参照。每个实验重复3批不同样本以上。

5. 肝组织SARA蛋白表达：免疫组织化学染色（两步法）：石蜡切片，经0.3%过氧化氢/甲醇液孵育去除内源性过氧化氢酶，磷酸盐缓冲液洗涤后以胃蛋白酶消化，而后以SARA抗体（1∶50）孵育，经磷酸盐缓冲液洗涤，辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体孵育，DAB显色。以磷酸盐缓冲液代替SARA抗体（一抗）作空白对照染色。

6. 统计学处理方法：以SPSS11.0中ANOVA程序进行单因素方差分析，以LSD进行两组比较；Correlate程序进行相关性检验。

结    果

1. 模型大鼠肝脏胶原生产与沉积的动态变化：造模早期肝组织Hyp含量轻度升高，至造模4周末时达到高峰，为正常组的1.5倍；此后随DMN染毒的停止，Hyp含量有所下降，但仍高于正常大鼠水平。HE与胶原染色显示，造模2周后肝细胞损伤坏死明显，胶原纤维沉积，出现菲薄的纤维间隔，4周末时胶原纤维沉积明显，出现较为宽大的完全纤维间隔与假小叶，形成明显的肝纤维化。造模停止后肝脏胶原沉积较造模4周末时减轻，肝纤维化有所恢复，但直至8周末时仍见纤维间隔，见表1和图1。

2. 模型大鼠肝脏SARA蛋白的免疫组织化学染色表达：免疫组织化学空白对照组无阳性染色表达。正常肝组织中可见明显的SARA蛋白表达，主要在肝窦周围的间质细胞；模型大鼠随DMN染毒延长与肝纤维化形成，肝组织SARA蛋白阳性染色较正常大鼠减少。染毒停止后随肝纤维化恢复，SARA蛋白阳染细胞数较4周末的纤维化阶段明显增加，见图2。

3. 模型大鼠肝脏TGFβ1、α-SMA与SARA蛋白的动态变化：Western blot分析表明，正常大鼠肝组织α-SMA与TGFβ1蛋白少量表达，造模2周后，模型大鼠肝组织的α-SMA与TGFβ1表达量均明显增加，至4周末左右达到高峰。DMN染毒停止后，α-SMA与TGFβ1有所下降，但仍高于正常水平。SARA蛋白在正常大鼠肝组织明显表达，造模早期（1d和3d）即有降低，4周时降至正常组的1/2水平；造模停止后，SARA表达量逐渐恢复，8周末时基本为正常大鼠水平，见图3，表2。

4. 大鼠肝组织SARA蛋白与TGFβ1、α-SMA及Hyp含量的相关性分析：直线相关回归分析表明，在肝纤维化形成与恢复阶段，SARA蛋白与TGFβ1和α-SMA的蛋白表达水平、及与Hyp含量之间均呈明显负相关，见表3。

讨    论

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的修复反应，以细胞外基质异常增生和过度沉积为特征，是多种慢性肝病的共同病理特征。TGFβ1具有多种生物活性，可参与炎症和组织修复等多种病理生理过程。业已证实，肝星状细胞活化是肝纤维化的细胞学基础，α-SMA是其活化标志物[4]。TGFβ1以自分泌与旁分泌两种形式促进HSC活化，是促肝纤维化形成的重要细胞因子[5]。TGFβ1主要通过TβR/Smads信号通路发挥其生物效应[6]，即胞外活化形式的TGFβ1与TβR-Ⅱ结合，诱导跨膜的TβR-Ⅱ/TβR-Ⅰ异二聚体形成引发胞内信号转导。胞内的SARA蛋白C端与TβR-Ⅰ直接结合，另一端与Smads蛋白结合，进而将Smads与TβR-Ⅰ相联接，促使Smads被TβR-Ⅰ的胞内激酶磷酸化，活化的Smads蛋白转位细胞核内，调控细胞效应基因表达。一般而言，SARA在TGFβ1胞内信号转导中起连接或桥梁作用。但是由于TGFβ1生物效应的多样性与其信号转导分子的复杂性，不同环境的TGFβ1生物效应往往具有不同的信号分子变化特点。了解SARA在肝纤维化的变化特点与功能作用，对于进一步认识肝纤维化分子病理，并为肝纤维化治疗学提供可能靶点等有重要意义。

DMN有明显而持续的肝毒性作用，DMN染毒是诱导肝纤维化动物模型的经典方法，在停止染毒后虽然不似四氯化碳诱导的肝纤维化模型可较快自愈，但其肝纤维化可一定程度上逆转恢复[7]。本实验中随DMN染毒时间延长，肝Hyp含量、α-SMA与TGFβ1表达逐渐增加，肝纤维化逐渐形成，造模4周末时可见明显的假小叶；而随成模后停止染毒的时间延长，肝脏胶原沉积逐渐减轻，α-SMA与TGFβ1表达减少，再次证实DMN肝纤维化的可逆恢复性，而且该可逆性与HSC活化的减弱有关。

实验中免疫组织化学染色发现，正常肝组织表达SARA蛋白，主要位于肝窦周围的间质细胞。随肝纤维化形成，SARA阳性染色减少；而随染毒停止后肝纤维化的减轻，SARA阳性染色有所增加恢复，纤维化肝脏的SARA蛋白表达也均主要在肝间质细胞。Western blot发现，肝损伤早期即出现SARA表达减少，4周末时的表达量仅为正常组的1/2；染毒停止后，SARA逐渐恢复至正常组水平，并与Hyp含量、TGFβ1与α-SMA表达呈明显负相关关系。我们既往体外观察研究结果发现[3]，SARA蛋白主要表达于原代培养1d静止HSC，随HSC培养时间延长与细胞活化，SARA蛋白表达显著减少。本实验结果意义与上述体外结果意义相一致，说明SARA蛋白是肝纤维化形成过程中TGFβ1信号转导的负性调节分子。 SARA是TGFβ1信号转导的连接分子，为何在其促肝纤维化的过程中表达反而减少？究其原因，可能主要在于Smad2,3不同的信号途径与功能作用。虽然Smad2,3均属胞内信号调节蛋白（R-Smads），均可磷酸化后进入核内直接调节基因表达。但在信号转导途径上，Smad2必须通过与SARA结合，而传递TGFβ的信号效应；而Smad3则无须SARA蛋白的结合，即使敲除Smad3的SARA结合位点，Smad3也同样可以介导TGFβ1的生物效应[8]。在功能作用上，我们曾发现[3]，TGFβ1主要促进静止HSC的Smad2磷酸化，效应主要表现为抑制HSC增殖；促进活化HSC的Smad3磷酸化，同时促进细胞生成细胞外基质。近期研究表明[9,10]，Smad3在HSC活化中起重要作用，是TGFβ1促纤维化不可或缺的直接信号分子，而基因敲除Smad2则不影响TGFβ1的促纤维化作用。提示Smad3 主要介导胞外基质生成，而Smad2与介导TGFβ1的细胞增殖抑制作用有关。因此，肝纤维化时SARA蛋白的减少，并不影响TGFβ1通过Smad3的促纤维化作用；而可能减少与Smad2的结合，下调TGFβ1通过Smad2的抑制细胞增殖作用，使得HSC大量增殖，而促进纤维化发展。

参  考  文  献

1Liu CH, Hu YY, Liu P, et al. Transforming growth factor β1 and liver fibrosis.  Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 1996, 4: 53-56.

刘成海,胡义扬,刘平,等.转化生长因子β1与肝纤维化.中华肝脏病杂志,1996,4:53-56.

2Zhao JF, Liu C, Liu CH. TGF-β intracellular signal transduction and Smads protein. Zhongguo Bingli Shengli Zazhi, 2002, 18 : 321-325.

赵俊芳,刘成,刘成海. 转化生长因子β胞内信号转导与Smads蛋白.中国病理生理杂志，2002,18:321-325.

3Liu C, Ga鏰 MD, Swenson ES, et al. Smads 2 and 3 are differentially activated by transforming growth factor-beta (TGF-beta ) in quiescent and activated hepatic stellate cells. Constitutive nuclear localization of Smads in activated cells is TGF-beta-independent. J Biol Chem, 2003, 278 : 11721-11728.

4Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem, 2000, 275: 2247-2250.

5Bissell DM, Roulot D, George J.  Transforming growth factor beta and the liver.  Hepatology, 2001, 34: 859-867.

6Massague J. TGF-beta signal transduction.  Annu Rev Biochem, 1998, 67: 753-791.

7Friedman SL, Bansal MB. Reversal or hepatic fibrosis-Fact or fantasy?  Hepatology, 2006, 43(2 Suppl 1): S82-88.

8Goto D, Nakajima H, Mori Y, et al.  Interaction between Smad anchor for receptor activation and Smad3 is not essential for TGF-beta/Smad3-mediated signaling. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 281: 1100-1105.

9Uemura M, Swenson ES, Gaca MD, et al.  Smad2 and Smad3 play different roles in rat hepatic stellate cell function and alpha-smoooth muscle actin organization. Mol Biol Cell, 2005, 16: 4214- 4224.

10Liu X, Wen FQ, Kobayashi T, et al. Smad3 mediates the TGF-beta- induced contraction of type I collagen gels by mouse embryo fibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton, 2003, 54: 248-253.

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