表达细胞色素P2E1C3A肝细胞系的建立及其对增殖的影响

【关键词】  细胞色素P450;  细胞系，C3A； 脂肪肝，非酒精性； 细胞增殖

The expression of CYP2E1 and its effect on the proliferation of C3A hepatocyte cell line   LIU Tian-hui, XU You-qing, YOU Hong, XU Yong, CONG Min, WANG Ping, JIA Ji-dong, WANG Bao-en.

【Key words】     Cytochrome P450;   C3A cell line;    Fatty liver, nonalcoholic;    Cell proliferation

【First author抯 address】   Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

Email:  liu_tianhui@163.com

细胞色素P450 2E1（Cytochrome-P450 2E1, CYP2E1）在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制中发挥重要作用。CYP2E1广泛参与细胞物质代谢，是否影响肝细胞增殖是一个值得探讨的问题，我们对CYP2E1对C3A肝细胞增殖的影响进行了初步探索。

一、材料与方法

1．  PCI-CYP2E1全长表达质粒的构建：设计CYP2E1全长引物，聚合酶链反应（PCR）扩增，插入PCI-neo质粒载体，构建出含人类CYP2E1完整基因的质粒PCI-CYP2E1。

2．稳定表达CYP2E1蛋白C3A细胞系的建立：取正常C3A细胞（北京佑安医院提供）分为C3A组：正常C3A；PCI组：转染PCI-neo空质粒；CYP2E1组：转染PCI-CYP2E1全长表达质粒。利用PCI-neo质粒载体的neo基因在加G418培养条件下对各组细胞进行筛选。

3．RT-PCR鉴定CYP2E1表达：提取总RNA，进行逆转录。每组样品均设立cDNA阴性对照（逆转录时不加MMV逆转录酶）。设计CYP2E1引物如下：上游5′-TCATAGCCG ACATCCTCTTC-3′，下游：5′-GTTGTGCTGGTGGTC TCTGT-3′。PCR扩增片段长度为367bp。

4．Western blot鉴定CYP2E1蛋白表达：提取总蛋白质；10% SDS-PAGE分离；转膜；封闭2h；1∶2500兔抗豚鼠CYP2E1多克隆抗体室温孵育3h；1∶2000羊抗兔IgG室温孵育1h；显色；X光胶片曝光。

5．细胞计数：取等量（4×105）PCI组及CYP2E1组细胞同样条件培养7d，记录光镜下结果，消化后细胞计数。

6．流式细胞仪检测各组细胞生长周期: 取上一步骤中消化所得细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2次；加入胰蛋白酶破膜10min；再加入RNA酶25min去除RNA；加入碘化丙啶（美国Sigma公司产品）4℃避光染色；以300目筛网收集单细胞约1×106，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

二、结果

1．转染细胞筛选结果：100μg/ml G418筛选约30d左右，C3A组全部死亡，而PCI组及CYP2E1组均形成多少不等的克隆。

2．RT-PCR鉴定结果: PCI组无阳性条带；CYP2E1组出现清晰的阳性条带，位于预期的约367bp位置，而相应的阴性对照中无阳性条带(图1)。说明CYP2E1组细胞成功表达CYP2E1 mRNA。

3. Western blot鉴定结果：CYP2E1组的细胞出现清晰的阳性条带，位于预期的相对分子量约为5.2×104的位置；PCI组的细胞在相应位置未出现阳性条带（图2）。说明CYP2E1组的细胞成功表达出CYP2E1蛋白。

4．光镜下结果及细胞计数结果：肉眼观及光镜下可见CYP2E1组的C3A细胞增殖明显要慢于PCI组的C3A细胞。2组各取等量细胞（4×105）在同样条件下培养，7d后消化计数。PCI组为1.75×106；CYP2E1组为1.5×106，见图3。

5．流式细胞检测结果：PCI组处于DNA合成期的细胞数量明显高于CYP2E1组，说明PCI-C3A增殖能力高于2E1-C3A（图4）。

三、讨论

关于NAFLD的发病机制，至今比较公认的“两次打击”学说。其初次打击主要是胰岛素抵抗，外周脂肪分解增加和胰岛素血症引起肝细胞脂肪堆积，并诱导其对损害因子的敏感性增高；二次打击主要是氧应激，最后导致炎症和纤维化。CYP2E1主要参与二次打击的氧应激，而氧化应激可引起DNA损伤、细胞直接损伤与炎症反应，最终导致NAFLD的发生[1]。已有学者证明NAFLD患者体内该酶活性增加，并与氧自由基含量呈正相关[2]。抗氧化剂番茄红素可以降低CYP2E1介导的花生四烯酸对肝细胞的毒性，同时还可以减轻由CYP2E1引起的肝细胞凋亡[3]。

在本研究中，我们成功建立了可稳定表达CYP2E1蛋白的C3A肝细胞系，并且发现CYP2E1过表达的C3A细胞增殖能力与转染空质粒的对照相比有明显降低。初步确认CYP2E1的表达可能影响C3A细胞的增殖。接下来我们需要进一步对C3A细胞的凋亡、氧化应激以及增殖相关因子变化等方面进行研究，确认CYP2E1对肝细胞增殖的影响机制。

参  考  文  献

1Robertson G, Leclercq I, Farrell GC. Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis. II. Cytochrome P-450 enzymes and oxidative stress. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001, 281: 1135-1139.

2Chitturi S, Farrell GC. Etiopathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Semin Liver Dis, 2001, 21: 27-41.                                                    

3Xu Y, Leo MA, Lieber CS. Lycopene attenuates alcoholic apoptosis in HepG2 cells expressing CYP2E1. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 308: 614-618.