血管紧张素原在肝纤维化形成和自发逆转过程中的表达

【关键词】  血管紧张素原； 肾素； 肝纤维化

Expression of angiotensinogen during development and spontaneous reversal of hepatic fibrosis   YANG Liu, LIU Hai-lin, HUO Li, WANG Lei.

【Key words】     Angiotensinogen;   Renin;   Liver fibrosis

【First author抯 address】   Department of Gastroenterology, Ninth People抯 Hospital Affiliated to the School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200011,China

Corresponding author:  LIU Hai-lin, Email: liuhailin@medmail.com.cn

肾素-血管紧张素系统（RAS）是机体调节血管张力和钠水代谢的内分泌系统，研究表明，多种组织或器官也能合成RAS的全部或大部分成分，以自分泌或旁分泌方式发挥作用，称为局部RAS。局部RAS主要与组织纤维化和（或）重构过程有关，如心肌梗死后纤维化、心肌肥厚、肾纤维化、皮肤纤维化等[1，2]。肝星状细胞（HSC）表达血管紧张素Ⅱ（AⅡ）、Ⅰ型受体（ATⅠ），并且AⅡ可以促进HSC分裂和增生[3]。为进一步了解组织局部RAS在肝纤维化中的作用，现动态检测了在四氯化碳（CCl4）诱导下大鼠肝纤维化形成与自发逆转过程中，肝脏和肾脏组织血管紧张素原（ANG）、肾素（REN）的表达。

一、材料与方法

1. 肝纤维化大鼠模型的建立和标本制备：90只SD大鼠，饲养于SPF级动物房。随机分为正常对照组（N组）10只和肝纤维化模型组80只。模型组大鼠予橄榄油配制40% CCl4腹壁皮下注射，3ml/kg，首剂加倍，每周2次。分别于第5、7周各随机处死10只大鼠作为F1和F2组，并在第7周处死10只N组大鼠。其余大鼠继续注射40% CCl4至第8周，在停止注射后第3、7、28、45、60天分别各处死10只大鼠，作为T1、T2、T3、T4、T5组。大鼠用30mg/kg氯胺酮肌注麻醉后，开腹，行门静脉插管，以40ml/min的速度向肝内灌注磷酸盐缓冲液（PBS），同时迅速剪断下腔静脉，使灌流液顺利流出。当肝脏转为黄白色，流出液澄清时停止灌流。用锐利刀片统一切取肝脏右叶约200mg和左肾-80℃冻存备用。另取肝脏右叶组织0.5cm×0.5cm×0.5cm大小各2～3块，3%戊二醛固定24h后,石蜡包埋、HE染色切片。造模过程中，共有10只大鼠死亡，未列入实验分组。

2. 肝纤维化分级: 由同一个资深病理科医师在不了解实验分组的情况下对肝纤维化进行分级[4]，共分为6级。

3. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测血管紧张素原与肾素mRNA水平: 取-80℃冻存的肝或肾组织，匀浆后用Trizol试剂盒提取总RNA。经逆转录合成cDNA，再进行PCR扩增。PCR引物：ANG：上游5′-GCCCAGGTCGCGATGAT-3′，下游5′-CACCACGGTGGACTGTAGCA-3′； REN：上游5′-AACATTACCAGGGCAACTTTCACT-3′，下游5′-AGATGTCGGGGAGGGTGGGT-3′。PCR步骤如下：首先95℃预变性3min，之后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共35个循环；最后72℃ 5min终止反应。扩增产物电泳，采用TANON凝胶图像分析系统拍照并行密度扫描分析，以β-肌动蛋白为内参照。

4. 血管紧张素原免疫组织化学染色：石蜡包埋的肝组织切片经烘烤、脱蜡、脱水、灭活内源性过氧酶，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，山羊血清封闭（室温30min），滴加第一抗体（抗ANG单克隆抗体，稀释浓度为1∶1000），37℃孵育1h，4℃过夜，PBS洗涤，每次5min，3次。滴加HRP-标记的羊抗鼠第二抗体（稀释浓度为1∶100），37℃孵育30min，PBS洗涤，DAB显色。

5. 统计学方法: 数据应用SPSS12.0统计软件包进行分析。各组肝纤维化分级采用K-W检验。计量资料进行单因素方差分析，肝纤维化分级与ANG之间相关性采用直线相关分析。

二、结果

1. 肝纤维化分级结果：注射CCl4第5周时，F1组大鼠均发生了不同程度的肝纤维化（Ⅲ级5只、Ⅳ级4只、Ⅴ级1只）；至第7周，F2组有2只大鼠形成早期肝硬化，Ⅳ级4只、V级4只。停止注射CCl4后，肝纤维化出现自发逆转，至第28天，T3组0级1只、Ⅰ、Ⅱ级各3只、Ⅲ级2只、Ⅳ级1只，肝纤维化分级与F2组相比, χ2＝13.57，P<0.01，差异有统计学意义。在第60天，T5组有8只大鼠的肝纤维化已完全逆转，Ⅰ级和Ⅱ级各1只。

2. 肝脏和肾脏组织血管紧张素原及肾素的mRNA表达：肝纤维化时，肝组织血管紧张素原的表达显著增加；随着肝纤维化的自发逆转，表达逐渐降低。两者呈显著相关（r＝0.94, P<0.01）。肾脏组织血管紧张素原的表达远低于肝组织，并且与肝纤维化无相关性（r＝0.43, P>0.05），见表1。肝组织未检测到REN表达。肾脏组织REN表达丰富，但与肝纤维化无关（r＝0.11, P>0.05）。

3. 血管紧张素原免疫组织化学染色：正常肝脏组织，血管紧张素原蛋白主要位于中央静脉周围的肝细胞内；而肝纤维化时，则主要见于增生的纤维间隔。当肝纤维化自发逆转至正常后，血管紧张素原蛋白又重新回复为由肝细胞合成，见图1。 

三、讨论

血管紧张素原是RAS的基本成分。血管紧张素原在肾素的作用下分解为血管紧张素Ⅰ，后者经血管紧张素转换酶（ACE）作用形成AⅡ。AⅡ主要通过其Ⅰ型受体发挥生理效应。大量的研究表明，局部RAS在心、肾纤维化中具有重要作用。AⅡ能够促进心脏和肾脏的肌成纤维细胞生长、增殖，上调转化生长因子β1表达，使细胞外基质合成增加，同时抑制基质金属蛋白酶生成，促进金属蛋白酶组织抑制因子-1表达，发挥多重促纤维化作用。肝脏也存在局部RAS[5, 6]。Paizis等[7]研究表明，结扎胆总管引起的肝纤维化大鼠肝组织ACE和AT1受体的基因表达上调。静息状态的人HSC几乎不表达RAS成分，而活化的人HSC高度表达REN、ACE，并分泌AⅡ[8]。本研究结果显示，随着肝纤维化的进展，血管紧张素的表达增高，在肝纤维化自发逆转过程中又逐渐降低，两者之间具有显著相关性（r＝0.94, P<0.01）。免疫细胞染色进一步证明在正常肝脏血管紧张素原由中央静脉周围的肝细胞合成，肝纤维化时则主要位于增生的纤维间隔，肝纤维化逆转后又重新恢复由肝细胞合成。这是因为：肝纤维化过程中，大量肝细胞坏死，HSC的活化，活化的HSC主要位于增生活跃的纤维组织内。肝脏局部产生的ANG，可诱导转化生长因子β1表达，诱导转化生长因子β1促进HSC活化，启动了肝纤维化的关键步骤[9]。活化的HSC大量转化为肌成纤维细胞，并可合成RAS的全部物质和所需的酶类，由此而产生的ANG、AⅡ又可再激活HSC，促进其增殖、转化。因此，肝纤维化进展中，随着HSC的不断活化，ANG表达显著增加，随着肝纤维化逆转，活化的HSC逐渐减少，肝脏实质细胞增多，故导致了ANG表达量和细胞分布变化。

关于肝脏是否表达肾素报道的结果尚不一致。本研究中无论是正常肝脏或肝纤维化时，在充分灌洗排除肝脏血液后，均未检测到肝组织有肾素mRNA表达。一种可能是肝脏本身不表达肾素，而来源于血液循环；也可能系肝组织表达水平极低，未能检出。肾脏血管紧张素的表达远低于肝脏，而肾素在肾脏高度表达，但肾脏血管紧张素和肾素的表达均与肝纤维化发展或逆转无关。这也支持主要是肝组织局部RAS参与肝纤维化。

CCl4诱导的大鼠肝纤维化在第7周时有少数已达到早期肝硬化，然而在停止注射CCl4后第28天，肝纤维化程度仍出现具有统计学意义的显著减轻，至第60天时，大部分大鼠已完全逆转至正常，证明早期肝硬化在去除病因后也是可以逆转的。至于肝纤维化发生逆转的时间，则与肝纤维化的严重程度有关。肝纤维化程度越重，逆转所需时间就越长。

肝组织局部血管紧张素原的表达与肝纤维化的形成和逆转显著相关。正常肝脏血管紧张素原主要由肝细胞分泌，而肝纤维化时则主要来源于增生的纤维组织。

参　考　文　献

1Lucius R, Gallinat S, Busche S, et al. Beyond blood pressure: new roles for angiotensin II. Cell Mol Life Sci, 1999, 56: 1008-1019.

2Selman M, Pardo A. Idiopathic pulmonary fibrosis: an epithelial/fibroblastic cross-talk disorder. Respir Res, 2002, 3: 3.

3Batalller R, Gines P, Nicolas JM, et al. Angiotensin II induces contraction and proliferation of human hepatic stellate cells. Gastroenterology, 2000, 118: 1149-1156.

4Ishak K, Baptista A, Bianchi L. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol, 1995, 22: 696-699.

5Barlucchi L, Leri A, Dostal DE, et al. Canine ventricular myocytes possess a rennin-angiotensin system that is upregulated with heart failure. Cir Res, 2001, 88: 298-304.

6Schultz Jel J, Witt SA, Glascock BJ, et al. TGF-beta 1 mediates the hypertrophic cardiomyocyte growth induced by angiotensin II. J Clin Invest,2002, 109: 787-796.

7Paizis G, Cooper ME, Schembri JM, et al. Up-regulation of components of the renin-angiotensin system in the bile duct-ligated rat liver.Gastroenterology, 2002, 123: 1667-1676.

8Bataller R, Sancho-Bru P, Gines P, et al. Activated human hepatic stellate cells express the renin-angiotensin system and synthesize angiotensin II.Gastroenterology, 2003, 125: 117-125.

9Powell EE, Edwards CJ, Hay JL, et al. Host genetic factors influence disease progression in chronic hepatitis C.Hepatology, 2000, 31: 828-833.