【关键词】 乙酰半胱氨酸； 脂多糖类； Toll样受体 Effect of NAC on LPS-induced toll-like receptor 2 and 4 expressions in murine macrophages JIN Xin, WU He-shui, TIAN Yuan, ZHANG Jin-hui, WANG Chun-you. 【Key words】 Acetylcysteine; Lipopolysaccharides; Toll-like receptor 【First author抯 address】 Center of Pancreatic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Corresponding author: WU He-shui, Email: whs1898@public.wh.hb.cn Toll样受体（TLRs）是病原微生物跨膜信号转导的重要受体，其中TLR2是一种具有广泛识别能力的“模式”受体，而TLR4在炎症反应中的作用尤为显著，体外观察证实它是细菌内毒素的识别与信号转导过程中的主要受体[1]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）可进入体内合成还原性谷胱甘肽，改变细胞氧化还原平衡状态[2]。现采用NAC调整巨噬细胞内活性氧（ROS）水平，观察其对脂多糖（LPS）所致小鼠巨噬细胞TLR2/4基因表达的影响。 一、材料与方法 1．试剂和仪器：DMEM培养基（无内毒素）及胎牛血清购自美国Gibco公司；LPS及NAC购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子（TNF）α酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自深圳晶美生物公司；TRIZOL Reagent购自美国Promega公司，聚合酶链反应（PCR）试剂购自日本Toyobo公司，引物及荧光探针由上海申友生物公司合成。 2．细胞培养及分组：（1）细胞培养：小鼠巨噬细胞株RAW264.7（华中科技大学同济医学院免疫教研室馈赠）以4ml/孔（1×106个细胞）接种于6孔培养板中， 3．实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TLR2/4 mRNA表达：收集培养的细胞，按TRIzol试剂盒提供的说明书提取总RNA。以总RNA为模板，OligodT为引物逆转录合成cDNA，SYBR Green荧光染料法进行实时荧光PCR。用β-肌动蛋白（β-actin）作内参照，各引物序列如下：TLR2上游引物为5′-GGCTTCCTCTTGGCCTGG-3′，下游引物为5′-GCCACCATTTCCACGGACT-3′；TLR4上游引物为5′-TGTGGAAGCCTTCCTGGATG-3′，下游引物为5′-CCTCTGCCTTCACTACAGAGACTTT-3′；β-actin上游引物为5′-GAAACTACCTTCAACTCCATC-3′，下游引物为5′-CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC-3′。反应条件： 4. ELISA法测定上清液TNFα浓度：收集细胞培养上清液，按照TNFα ELISA试剂盒说明书操作，以Microplate reader读取450nm波长处的吸光度值，并根据标准曲线计算各组细胞培养上清液中TNFα的含量，绘制图表，进行组间比较。 5. 统计学方法：各计量资料均以x-±s表示，用SPSS12.0版统计软件包进行处理，多样本均数采用方差分析，样本均数间相关性采用线性回归分析。 二、结果 1．LPS对小鼠巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的影响：正常培养的RAW264.7细胞也能表达TLR2/4 mRNA，但其表达量较微弱。荧光定量PCR结果表明，用10μg/ml LPS刺激后，RAW264.7细胞的TLR2 mRNA表达量迅速上升，3h即达高峰，6h仍持续保持在较高水平，12h也未见有所降低。而TLR4 mRNA的表达量随时间的推移表现为逐步升高，直至12h其表达仍未见有所降低。LPS对照组中各时相点TLR2/4 mRNA的表达与PBS对照组相比，差异均有极显著的统计学意义（F＝32，P<0.01）。见表1，2。 2. NAC对LPS诱导的TLR2/4 mRNA表达的影响：NAC预处理后加LPS刺激，TLR2/4 mRNA的表达虽较PBS对照组亦显著升高（F＝17.3，P<0.01），但与LPS对照组相比较，各时相点TLR2/4 mRNA的表达均显著降低（F＝21.6，P<0.01），差异有统计学意义。TLR2 mRNA的表达从1h开始逐步上升，于6h达峰值后开始下降，并非如同LPS对照组从3h开始至12h皆处于高表达平台期。而TLR4 mRNA的表达也于6h达峰值后即开始下降，与LPS对照组相比表达峰值提前。见表1，2。 3．LPS单独刺激对TNFα水平的影响：正常培养的RAW264.7细胞上清液中TNFα的释放量极低，其浓度低于15pg/ml。以10μg/ml LPS刺激后，TNFα表达水平随时间的推移表现为先升高后降低，但仍显著高于PBS对照组（F＝654.2，P<0.01），见表3。 4．NAC对LPS诱导的TNFα生成的影响：当加入NAC预处理后再以LPS刺激RAW264.7细胞，培养上清液中TNFα含量随时间推移亦逐步升高，但与LPS对照组相比较各时相点TNFα水平显著降低，差异有统计学意义（F＝22.3，P<0.01），见表3。 三、讨论 单核巨噬细胞是机体免疫系统中的一类重要细胞，它在炎症反应中发挥重要作用。内毒素（如LPS等）毒性物质可以激活巨噬细胞表面跨膜受体TLR2/4。目前研究表明，TLR2是LPS信号转导受体复合物的重要组成部分，但其与LPS的亲和力较低。而TLR4 则是LPS信号向细胞内传导的门户蛋白，其主要经以下两条途径进行信号转导：TLR4-MyD88/白细胞介素（IL）-1 受体相关激酶-NF-κB诱导激酶/NF-κB途径和TLR4-MyD88/IL-1受体相关激酶-丝裂原活化蛋白激酶途径，最终导致炎症介质，如TNFα、IL-1β和干扰素γ等的合成与释放[3, 4]。同时巨噬细胞还可以产生ROS，促进多种炎性细胞因子基因的表达[5, 6]，从而发挥杀灭病原体的作用。但如果这些炎性细胞因子和氧自由基产生过多，则会对正常细胞和组织产生损害。同时，由于巨噬细胞胞膜含有较多不饱和脂肪酸，且自身产生ROS，故巨噬细胞对ROS所致的氧化损伤非常敏感。因此，研究抗氧化剂对巨噬细胞的作用显得尤为重要。 NAC是左旋半胱氨酸的天然衍生物，分子内含有活跃的-SH基团，所以具有还原二硫化物的功能。NAC可通过脱乙酰基作用诱导细胞内还原性谷胱甘肽的聚集，促进抗氧化作用[2, 7]，提高胞内去毒性作用和减少氧自由基的释放，从而阻断了ROS的第二信使作用，阻断基因转录的启动，调节细胞增殖和凋亡。NAC还能提高中性粒细胞的吞噬作用，减少“呼吸爆发”[8]。 本实验结果表明，小鼠巨噬细胞在LPS刺激后，TLR2/4 mRNA的表达显著上调，说明其信号通路已被激活，而采用NAC预处理却可明显降低这种活化水平。同时，以TNFα为代表研究通路下游终末炎症反应因子的表达，结果发现NAC虽然不能完全阻遏TLR2/4的信号向细胞内传导，但却明显抑制了LPS诱导的炎性产物表达。进一步分析发现，LPS刺激后6h TNFα的表达即迅速达到峰值，其大量表达可能进一步促进TLR2/4 mRNA 表达的上调，以致TLR2/4 mRNA 的表达峰值明显晚于TNFα，而上调的TLR2/4 又作为新的受体介导更多的细胞活化和炎症介质的生成。这样，在TLR2/4 与炎症介质的基因表达之间形成一个“正反馈”环，使炎症反应不断递增放大形成瀑链式反应[9]。NAC作为一个含有-SH基的小分子化合物易于进入细胞，去乙酰化后生成半胱氨酸，预先补充细胞内GSH水平，提高GSH/氧化型谷胱甘肽比值以增进GSH的抗氧化能力，故大大减少了LPS刺激导致细胞内ROS水平的过度升高。据报道，TLR2/4信号下游途径上各激酶的激活有赖于ROS的氧化性机制[10]。因此，NAC最终可能直接或间接的抑制了下游关键因子NF-κB核转录，减少了致炎细胞因子的产生，从而使在LPS刺激下TLR2/4与炎症介质之间的动态递增趋势得以调整和削弱。本实验结果证明了这一点，NAC在明显降低TLR2/4和TNFα表达的同时，还促使TLR2 mRNA由高平台表达变为波动表达，TLR4 mRNA表达峰值提前，这在很大程度上重新调节了炎症信号传导通路的表达。 NAC动态参与炎症信号通路的表达，抑制巨噬细胞产生细胞因子，从而既有利于机体对外界病原体的免疫应答，又可防止免疫细胞过度激活而造成机体损伤。NAC对巨噬细胞的这一双向调节作用，有望在各种炎症性疾病的治疗中得到广泛应用。 参 考 文 献 1Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol, 1999, 162: 3749-3752. 2Victor VM, Rocha M, De 3Li HY, 李红云，姚咏明，盛志勇．Toll样受体与脓毒症的研究进展.中华烧伤杂志,2002,18:314-317． 4Kirschning CJ, Bauer S. Toll-like receptors: cellular signal transducers for exogenous molecular patterns causing immune responses. Int J Med Microbiol, 2001, 291: 251-260. 5Gosset P, Wallaert B, Tonnel AB, et al. Thiol regulation of the production of TNF-α, IL-6 and IL-8 by human alveolar macrophages. Eur Respir J, 1999, 14: 98-105. 6Neuschwander-Tetri BA, Bellezzo JM, Brittonm RS, et al. Thiol regulation of endotoxin-induced release of tumour necrosis factor alpha from isolated rat Kupffer cells. Biochem J, 1996, 320: 1005-1010. 7Victor VM, De 8Mulhall KJ, 9Wu HS, Zhang JX, Zhang JH, et al. The change of toll-like receptor expression between early and delayed surgical treatment in severe acute pancreatitis. Zhonghua Jizhen Yixue Zazhi, 2004, 13: 682-684. 吴河水,张进祥,张锦辉,等.重症急性胰腺炎患者早期或晚期手术时外周血有核细胞Toll样受体表达差异及意义.中华急诊医学杂志，2004,13:682-684． 10Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, et al. Involvement of reactive oxygen species in Toll-like receptor 4-dependent activation of NF-kappa B. J Immunol, 2004, 172: 2522-2529.
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