【关键词】 癌，肝细胞； 免疫毒素类； 蜂毒肽； 荧光抗体蛋白技术
Expression of melittin tagged with green fluorescent protein and its use in hepatocellular carcinoma treatment CHEN Jiang, WANG Wei-yu, LU Zhi-xian, CHENG Hua-li, CHEN Rong-fang, PAN Yu-hong, WU Xiao-long, ZHU Jian-zhong, CAO Li-min.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Immunotoxins; Melittin; Fluorescent antibody technique
【First author抯 address】 Clinic Laboratory, Third Hospital Affiliated to Nantong University, Wuxi 214041, China
Corresponding author: CAO Li-min, Email: chali_cao@yahoo.com.cn
蜂毒是一种成分复杂的混合物,主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其他物质。在蜂毒的各个组分中,研究较多的是蜂毒溶血肽。蜂毒溶血肽又称蜂毒肽，最近研究表明蜂毒肽（Mel）具有较好的抗肝癌效应[1]。Mel短肽一般直接从蜜蜂毒腺中分离或通过化学方法合成。本研究通过体外合成的Mel基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因进行融合，在大肠杆菌中实现高水平表达，得到纯度和产率满意的Mel-EGFP融合蛋白，并显示明显的抗肝癌效应，现将研究结果报道如下。
一、材料与方法
1. 主要试剂和工具酶：异丙基-β-半乳糖苷（IPTG）、低分子量蛋白标准品、DNA聚合酶、限制性内切酶NocⅠ、HindⅢ和XhoⅠ，T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、质粒DNA纯化试剂盒、聚合酶链反应（PCR）产物纯化试剂盒、DNA标准分子量（中国华美生物工程公司）；蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等（上海生工生物工程公司）；NiSO4、氯化钠等（无锡市华东化学试剂有限公司）四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂（美国Gibco公司）；Ni2+ chelating HiTrap HP column及HiTrap Desalting column（安玛西亚生物技术中国有限公司）；CytoTox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay Kit（上海普洛麦格生物产品有限公司），寡核苷酸单链和引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。
2. 质粒和细胞株：质粒pET-32c、pEGFP-N1、宿主菌DH5α和BL21、人肝癌细胞株HepG2均由本市保存。
3．基因表达载体的构建：（1）根据GenBank（X02007）中Melittin（GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ）相对应的DNA序列，设计两条寡核苷酸单链，在两端引入NcoⅠ和HindⅢ两个酶切位点，在C端引入接头PSPPRP（CCATCGCC GCCAAGACCA）。Mel-P1：5′-CATGGGAATTGGAGCA GTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATA AGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGCCATCGCCG CCAAGACCAA-3′；Mel-P2：3′-CCTTAACCTCGTCAAG ACTTCCATAATTGGTGTCCTAACGGGCGGGAGTATT CAACCTAATTTGCATTCTCCGTTGTCGGTAGCGGCGGTT CTGGTTTCG-5′。在PCR仪中退火形成双链，30%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果。（2）根据EGFP的DNA序列设计一对引物，在P1和P2的5′端引HindⅢ和XhoⅠ两个酶切位点，EGFP-P1：5′-CGAAGCTTATGGTGAGCAAGG GC-3′；EGFP-P2：5′-ATCTCGAGCTTGTACAGCTCGTC-3′，挑选单菌落（含质粒pEGFP-N1）接种至LB肉汤培养基，37℃培养过夜，采用质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，以此为PCR模板，加入设计的引物GP1和GP2及PCR试剂进行扩增，反应条件为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。（3）用HindⅢ、XhoⅠ消化PCR扩增的目的基因片段和原核表达质粒pET-32c，取1.5μl经Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切纯化的EGFP基因片段和6.5μl酶切纯化后的pET-32c载体，加1μl连接缓冲液及1μl T4 DNA连接酶，22℃连接2h。取10μl连接产物转化200μl感受态细胞，37℃培养过夜。挑取单菌落接种至3ml Luria-Bertani肉汤培养基，37℃振摇过夜，10g/L琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定为阳性重组质粒，HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定，以及DNA测序证实；取3μl退火的Melittin寡核苷酸双链和1μl经NcoⅠ、Hind Ⅲ酶切纯化后的pET-32c载体，加1μl连接缓冲液及1μl T4 DNA连接酶，16℃连接过夜，EcoRⅠ单酶切鉴定阳性重组质粒。
4．蜂毒肽-增强型绿色荧光蛋白（Mel-EGFP）的诱导表达和纯化：接种含Mel-EGFP/pET-32c的BL21单菌落至10ml LB肉汤，37℃ 200r/min振荡培养过夜。1∶100转种至1000ml肉汤，振荡培养3.5h左右，加IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3h。取1 ml菌液，12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测Mel-EGFPK基因的表达情况。常规方法处理包涵体，采用Ni2+亲和柱纯化融合蛋白，并用折叠缓冲液复性。同样方法诱导表达和纯化EGFP。
5．荧光检测：（1）取诱导表达的含Mel-EGFP/pET-32c的BL21大肠杆菌菌液1ml，12000r/min离心2min，沉淀用1ml的等渗盐水洗涤2遍，再用1ml的等渗盐水重悬后荧光显微镜下观察；（2）取5×106培养的HepG2细胞株100μl用1ml的等渗盐水洗涤2遍，用100μl的PBS重悬，加入纯化的Mel-EGFP重组融合蛋白或GFP重组蛋白100μl（0.5mg/ml），37℃孵育30min，荧光显微镜下观察。
6．Mel-EGFP融合蛋白对HepG2细胞的杀伤：（1）乳酸脱氢酶（LDH）释放试验[2]：HepG2细胞为2×105/ml，设3个复孔。50ng/ml Mel-EGFP和靶细胞作用4h，反应终止后，每孔取50μl上清液检测LDH的释放，以492nm波长测定A值。（2）细胞生长抑制试验：调上述细胞浓度为1×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，每组设5个样品孔，分别加入终浓度为0、50、100、200ng/ml的Mel-EGFP，其中不加Mel-EGFP处理（即0ng/ml）的3孔分别作为相应对照组，以上每份样品均设3个复孔，同样方法处理3块培养板，1 h后加入终浓度为150μmol/L的更昔洛伟，置于37℃体积分数5% CO2培养箱培养，分别于24、48、72h各取出1块培养板，1000r/min离心5min，去上清液，每孔加入MTT（5mg/ml）10μl，继续培养4h，每孔加入100μl二甲亚砜混匀，570nm测A值，细胞生长抑制率（%）= [A570（对照）-A570（实验）/A570（对照）]×100%。
7．统计学分析：利用SAS统计分析软件对各实验组的细胞生长抑制率与其对照组的差异显著性进行t检验分析。
二、结果
1. 原核表达载体Mel-EGFP/pET-32c的构建：将制备好的EGFP的PCR片段亚克隆至高效原核表达载体pET-32c中，质粒PCR鉴定阳性克隆；将退火形成的Mel寡核苷酸片段通过亚克隆至重组质粒EGFP/pET-32c的NcoⅠ和Hind Ⅲ两酶切位点之间，亚克隆成功使NcoⅠ和Hind Ⅲ两酶切位点间EcoRⅠ酶切位点消失。通过EcoRⅠ单酶切不能切开的为重组阳性质粒Mel-EGFP/pET-32c，见图1B泳道3。而对照pET-32c空载体经EcoRⅠ单酶切后形成线性条带（图1B）；核苷酸序列测定结果证实表达载体构建成功。
2．Mel-EGFP基因的表达：含重组表达质粒Mel-EGFP/pET-32c的BL21菌经1mmol/L的IPTG诱导下，T7启动子调控Mel-EGFP融合蛋白的表达（图1A），表达产物经12%的SDS-PAGE分析在48.9×103左右显示条带，符合Mel-EGFP与表达标签融合蛋白的理论值（图1C泳道3）。对表达菌液超声后上清液和沉淀的SDS-PAGE检测表明，融合表达的Mel-EGFP以包涵体的形式存在。通过Ni2+亲和柱纯化获得较纯的Mel-EGFP重组融合蛋白（图1C泳道4），经核酸蛋白分析仪测定其浓度为0.4mg/ml（图1）。
3. 荧光检测：在荧光显微镜下可以观察到诱导表达的含Mel-EGFP/pET-32c的BL21大肠杆菌通体发出较强的绿色荧光（图2B）；HepG2细胞与纯化的Mel-EGFP重组融合蛋白孵育后，可见在表膜外周有绿色荧光的聚集（图2E）。
4. Mel-EGFP融合蛋白对HepG2细胞的毒性试验：LDH释放试验表明，Mel-EGFP能破坏HepG2细胞细胞膜，使LDH释放（图3）。Mel-EGFP融合蛋白对HepG2细胞的杀伤试验结果显示，低浓度（50ng/ml）Mel-EGFP融合蛋白对其的抑制率在第三天达到了75.4%，且抑制率与Mel-EGFP浓度及作用时间呈正相关（图4），t检验分析表明差异有统计学意义。
三、讨论
Melittin是意大利蜜蜂毒的主要成分之一，由26个氨基酸组成，以往临床上主要用于治疗自身免疫性疾病。近20年来， 先后发现对多种实验性肿瘤有强烈的杀灭作用[3, 4]，引起了人们的极大关注。蜂毒肽Melittin抗肿瘤的机制有多种：溶解线粒体膜以抑制细胞呼吸，可通过阻抑氧化磷酸化对一些肿瘤产生抑制作用，其中最主要是直接结合细胞膜，使肿瘤细胞膜溶解，从而发挥抗肿瘤作用[1]。从天然的蜂毒中纯化Melittin不仅工艺复杂，且纯度不高，化学合成Melittin成本太高，目前更倾向于通过基因工程手段获得Melittin。然而，在大肠杆菌中表达Melittin得率很低，一方面Melittin本身是一种抗菌肽，对宿主菌有抑制作用，导致合成Melittin蛋白效率降低；另一方面Melittin作为一种外源性短肽很容易被表达菌蛋白酶识别并降解；不易纯化；因其分子量太小，很难判断是否表达[5]。
绿色荧光蛋白（GFP）最初是由Morise等从发绿色荧光的腔肠动物水母提纯出来的，GFP含238个氨基酸,分子量约（27～30）×103,它的活性部位,是由其氨基酸主链上65～67位氨基酸(丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸)环化构成GFP独特的杂环结构发色团[6]，目前应用较多的是经突变改造，即EGFP，不仅发射出的荧光强度要增强6倍以上，而且更适合在大肠杆菌中高效表达[7，8]。将抗菌肽与EGFP在大肠杆菌中融合表达有利于提高抗菌肽的得率而不影响本身活性[9]。
本研究将体外合成的Melittin寡核苷酸与EGFP基因融合，置于高效原核表达载体pET-32c T7启动子之后成功高效表达融合蛋白Mel-EGFP，使融合蛋白的N端和C末端均携带His标签，有利于提高纯化效率。该融合蛋白理论上具有以下优点：（1）Mel-EGFP融合蛋白主要以可溶性和包涵体两种形式存在，其中以包涵体形式为主，利用可溶性表达的融合蛋白发出的荧光可直接用荧光显微镜判断Mel-EGFP的表达情况；（2）大部分Mel-EGFP表达后在EGFP的引导下迅速形成包涵体，以有效避免被细菌蛋白酶系统的降解；（3）此外，EGFP是一个无毒的比较稳定的蛋白，似乎也能保护融合于N端的抗菌短肽Melittin，耐受纯化包涵体过程中各种条件的变化，如超声、变性、复性等而不改变其特性；（4）用荧光显微镜直接观察纯化的Mel-EGFP结合至肝癌细胞膜表面。Mel-EGFP破坏肝癌细胞膜的完整性使细胞内的LDH释放到培养上清中证实表达的Mel-EGFP具有生物学活性，具体机制还有待进一步研究。
研究结果为进一步构建单链抗体靶向Melittin抗肝癌研究奠定了基础。
参 考 文 献
1Ling CQ, Li B, Zhang C, et al. Inhibitory effect of recombinant adenovirus carrying melittin gene on hepatocellular carcinoma. Ann Oncol, 2005, 16: 109-115.
2Choo AB, Dunn RD, Broady KW, et al. Soluble expression of a functional recombinant cytolytic immunotoxin in insect cells. Protein Expr Purif, 2002, 24: 338-347.
3Kubo H, Loegering DA, Adolphson CR, et al. Cytotoxic properties of eosinophil granule major basic protein for tumor cells. Int Arch Allergy Immunol, 1999, 118: 426-428.
4Lee SY, Park HS, Lee SJ, et al. Melittin exerts multiple effects on the release of free fatty acids from L1210 cells: lack of selective activation of phospholipase A2 by melittin. Arch Biochem Biophys, 2001, 389: 57-67.
5Shi WJ, Xu HJ, Cheng JA, et al. Expression of the melittin gene of Apis cerana cerana in Escherichia coli.Protein Expr Purif, 2004, 37: 213-219.
6Chiang CF, Okou DT, Griffin TB, et al. Green fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys, 2001, 394: 229-235.
7Drew DE, von Heijne G, Nordlund P, et al. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett, 2001, 507: 220-224.
8Casey JL, Coley AM, Tilley LM, et al. Green fluorescent antibodies: novel in vitro tools. Protein Eng, 2000, 13: 445-452.
9Skosyrev VS, Rudenko NV, Yakhnin AV, et al. EGFP as a fusion partner for the expression and organic extraction of small polypeptides. Protein Expr Purif, 2003, 27: 55-62.
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