【摘要】 目的 观察Rho/Rho激酶(ROCK)信号转导通路抑制剂——法舒地尔，对肝星状细胞（HSC）黏附、迁移和增殖的影响。 方法 将培养的HSC分为以下5组：对照组；法舒地尔12.5μmol/L组；法舒地尔25μmol/L组；法舒地尔50μmol/L组；法舒地尔100μmol/L组。采用甲苯胺蓝染色法测定细胞黏附率，Boyden Chamber小室测定HSC跨膜迁移数量，用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖，Western blot检测HSC RhoA、p-MLC(Thr18/Ser19)和α-平滑肌肌动蛋白的表达。 结果 法舒地尔对HSC的黏附、迁移和增殖均具有抑制作用，随着浓度增加，抑制作用加强；法舒地尔抑制HSC的α-平滑肌肌动蛋白表达，并且对Rho/ROCK信号转导通路关键信号分子p-MLC(Thr18/Ser19)的蛋白表达有抑制作用。 结论 法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路对细胞骨架的调节作用抑制HSC黏附、迁移和增殖。 【关键词】 肝纤维化； 肌球蛋白轻链； 肝星状细胞； 法舒地尔 Fasudil inhibites HSC adhesion, migration and proliferation via Rho/ROCK pathway WANG Yu-zhen, JIANG Hui-qing, HU Cai-xia, CHEN Xin. Department of Gastroenterology, Corresponding author: JIANG Hui-qing, Email: huiqingjiang@yahoo.com.cn 【Abstract】 Objective To observe the effects of fasudil, a Rho/ROCK signaling pathways inhibitor, on adhesion, migration and proliferation of hepatic stellate cells (HSCs). Methods Cultured HSCs were divided into 5 groups. Fasudil was added to 4 groups in a concentration of 12.5, 25, 50, and 100μmol/L, respectively. A group without fasudil added served as untreated controls. The adhesive inhibition effect of fasudil on HSCs was examined by toluidine blue colorimetric assay, the inhibition of migration of HSCs was evaluated by a modified Boyden chamber, and cell proliferation was assessed by MTT assay. The protein levels of RhoA, p-MLC (Thr18/Ser19) and α-SMA were assayed by Western blot. Results Fasudil inhibited HSC adhesion, proliferation and LPA-induced migration in a concentration-dependent manner; the protein expressions of α-SMA and p-MLC (Thr18/Ser19) were significantly decreased in the presence of fasudil. Conclusion Fasudil can inhibit HSC adhesion, migration and proliferation by supressing the cytoskeleton regulation function of Rho/ROCK signaling pathways. 【Key words】 Liver fibrosis; Myosin light chains; Hepatic stellate cells; Fasudil 法舒地尔是Rho/ROCK信号通路的选择性抑制剂，不仅能抑制细胞内游离Ca2+的活动，而且抑制细胞内肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化的水平，抑制细胞骨架功能。本研究通过体外细胞培养技术，探讨法舒地尔对肝星状细胞（HSC）黏附、迁移和增殖能力的影响。 材料与方法 1．材料：大鼠HSC株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化HSC，通过在四氯化碳诱发的肝硬化大鼠肝脏中分离并培养使细胞自发获得永生性，置于液氮中冷冻保存。RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品，Boyden小室和硝酸纤维素微孔滤膜（NC膜）购自江苏海门麒麟医用仪器厂，川威盐酸法舒地尔注射液为天津红日药业股份有限公司产品，溶血磷脂酸（LPA）购自美国Sigma公司，兔抗RhoA多克隆抗体、山羊抗磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）（Thr18/Ser19）多克隆抗体、小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。 2．细胞培养：复苏冷冻保存于液氮中的HSC后，接种于含8%胎牛血清的RMPI 1640培养液中， 3．细胞黏附实验：取常规传代培养的HSC，经消化、洗涤后，调整细胞浓度为1×105/ml，取96孔平底细胞培养板，每孔加入2×104个细胞（即200μl/孔），按实验分组干预细胞24h，每组平行设6个复孔。磷酸盐缓冲液洗涤未黏附的细胞3次，每次10min。4%多聚甲醛固定5min，0.5%甲苯胺蓝染色5min，1%十二烷基硫酸钠裂解细胞。在595nm波长下，用酶标仪测定吸光度值（A值），计算细胞黏附抑制率。 4．HSC跨膜迁移实验：用改良的Boyden小室进行，硝酸纤维素微孔滤膜孔径为8μm。用含2%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度，将细胞以3×105个/孔接种至上层小室，按实验分组加入法舒地尔，下室加入10μmol/L LPA 1ml，培养24h后取出滤膜，用棉签轻轻擦去膜上面的细胞后，用甲醛固定20min。自来水漂洗，苏木精染色10min，显微镜下随机计数6个视野的细胞数，每组实验重复3次。 5. MTT法测定细胞增殖：96孔培养板中加入细胞3×104/孔，每孔加入含不同浓度法舒地尔（0、12.5、25、50、100μmol/L）的2%血清RPMI 1640培养液，作用24h（每组设6个复孔），经台盼蓝染色，活细胞达95%以上。在培养终止前4h，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，继续孵育4h。弃培养液，加入二甲基亚砜150μl，振荡15min。选择490nm波长，用酶联免疫检测仪测定A值，并计算增殖抑制率。 6．Western blot：将不同浓度法舒地尔与HSC共同培养24h，弃上清液，冰冷的磷酸盐缓冲液漂洗2次，用100μl改良的RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。蛋白上样量为70μg，进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶电泳，NC转膜，非特异性封闭；加入第一抗体，兔抗RhoA多克隆抗体（1∶500）、山羊抗p-MLC（Thr18/Ser19）多克隆抗体（1∶500），小鼠抗α-SMA抗体（1∶200）， 7．统计学处理：计量资料以x-±s表示，利用SAS软件进行统计分析。采用t检验，两参数间的关系采用直线相关分析。 结 果 1. 法舒地尔抑制HSC黏附：不同浓度法舒地尔与HSC共同培养后，随着干预浓度增加，黏附率下降，与对照组相比，法舒地尔12.5、25、50、100μmol/L四种浓度的黏附抑制率分别为13.3%，36.7%，41.7%，62.4%；法舒地尔组四种不同浓度HSC的A值与对照组比较差异有统计学意义（t值分别为2.59、6.52、7.77、11.70，P值均<0.05），见图1。 2．法舒地尔抑制HSC迁移：LPA使HSC迁移数量明显增多，比对照组增加了6倍；法舒地尔抑制了LPA诱导的HSC迁移，随着法舒地尔干预浓度增加，细胞迁移数量下降，100μmol/L的法舒地尔组比单纯LPA组HSC迁移数量下降了80%，见图2，图3。 3．法舒地尔抑制HSC增殖：法舒地尔与HSC共同培养后，未见明显不良反应，法舒地尔浓度增加后，细胞增殖活性降低，细胞增殖活性与法舒地尔浓度呈负相关（r＝－0.9489，P<0.01），见表1。 4．法舒地尔对HSC表达α-SMA和p-MLC（Thr18/Ser19）的影响：活化的HSC分别在24×103、43×103、18×103的位置上出现阳性杂交带，为RhoA、α-SMA和p-MLC（Thr18/Ser19）的蛋白表达。用法舒地尔与HSC共同培养后，α-SMA和p-MLC（Thr18/Ser19）的蛋白表达与对照组比较明显下降，法舒地尔干预浓度越高，蛋白表达下降趋势越明显，见图4。 讨 论 Rho激活可引起包括HSC在内的各种类型细胞应力纤维和黏着斑的形成[1]。Yee[2]的研究表明，Rho信号通路通过调节肌动蛋白骨架而诱导活化的HSC形态发生改变。本研究结果显示，活化的HSC表达Rho/ROCK关键信号分子RhoA和p-MLC，RhoA是该信号通路的起始点，而p-MLC是最后效应分子，说明该信号通路与HSC的活化有关。激活Rho/ROCK信号通路使细胞胞质内肌球蛋白轻链磷酸化水平升高，肌动-肌球蛋白交联增加，从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，引起细胞形态和功能改变。应用ROCK抑制剂Y-27632抑制内皮素诱导的HSC收缩和门静脉高压的形成[3]，但尚未应用于临床。本研究显示应用法舒地尔干预HSC后，p-MLC的蛋白表达明显下将，随着干预浓度增加，表达量逐渐减少，说明法舒地尔对于Rho/ROCK信号通路激活HSC具有抑制作用。法舒地尔的作用并不是对HSC的毒性作用所致，因为实验范围内的剂量并没有减少HSC的存活率。 本实验发现法舒地尔降低了HSC的α-SMA表达，而且呈浓度依赖关系；但是法舒地尔并没有完全抑制HSC的α-SMA表达，可能Rho信号通路的其他成员也参与了HSC的活化过程。肝纤维化发生过程中HSC的积聚是由于增殖和迁移所致，本研究发现法舒地尔抑制了HSC的增殖；LPA是RhoA激动剂，通过激活RhoA而激活Rho信号通路；LPA诱发神经鞘细胞肌动蛋白改变和细胞迁移[4]。本研究证实了LPA能使HSC的迁移数量明显增多，而法舒地尔抑制了LPA诱导的HSC迁移；同时也抑制了HSC的黏附功能。法舒地尔是目前已知的惟一能应用于临床的Rho信号通路抑制剂，它通过抑制细胞内肌球蛋白轻链磷酸化的水平而抑制细胞骨架功能，Nishikimi等[5]研究发现法舒地尔能明显减轻输尿管梗阻导致的肾小管间质纤维化。而本研究只是观察到法舒地尔对体外的HSC的迁移、黏附和增殖具有抑制作用，法舒地尔对肝纤维化是否具有治疗作用，有待进一步研究证实。 参 考 文 献 1Amano M, Chihara K, Kimura K, et al. Formation of actin stress fibers and focal adhesions enhanced by Rho-kinase. Science, 1997, 275: 1308-1311. 2Yee HF Jr. Rho directs activation-associated changes in rat hepatic stellate cell morphology via regulation of the actin cytoskeleton. Hepatology, 1998, 28: 843-850. 3Kawada N, Seki S, Kuroki T, et al. ROCK inhibitor Y-27632 attenuates stellate cell contraction and portal pressure increase induced by endothelin-1. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 266: 296-300. 4Barber SC, Mellor H, Gampel A, et al. S1P and LPA trigger Schwann cell actin changes and migration. Eur J Neurosci, 2004, 19: 3142-3150. 5Nishikimi T, Matsuoka H. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury: renoprotective effect of rho-kinase inhibitor in hypertensive glomerulosclerosis. J Pharmacol Sci, 2006, 100: 22-28. 《中华肝脏病杂志》版权 |