内毒素受体在肝星状细胞的表达及其作用

【摘要】  目的  了解内毒素受体在肝星状细胞活化中的变化和作用。 方法  分离正常大鼠的肝星状细胞，以逆转录聚合酶链反应法检测其在体外培养过程中内毒素受体（CD14和TLR4）mRNA的表达变化。以细胞免疫染色法检测肝星状细胞内毒素受体CD14的表达。制作肝纤维化和肝硬化的大鼠模型，免疫组织化学法动态检测肝组织内CD14和α平滑肌肌动蛋白的表达变化和定位。 结果  初分离的肝星状细胞表达低水平的CD14 mRNA，不表达TLR4 mRNA，培养活化的肝星状细胞内毒素受体的表达增强，内毒素可上调这种表达。体外培养10d的肝星状细胞表达CD14蛋白，内毒素作用后CD14表达更明显。在肝纤维化的发展过程中，肝组织内CD14阳性细胞增多，阳性细胞多分布于肝窦周围，晚期CD14阳性细胞聚集在纤维隔内，与α平滑肌肌动蛋白阳性细胞的分布一致。 结论  肝星状细胞在体内外的活化过程中内毒素受体的表达增强，因此，内毒素受体可能参与肝星状细胞在肝脏炎症和纤维化中的作用。

【关键词】  肝纤维化； 肝星状细胞； CD14； Toll样受体

 

【Abstract】    Objective    To investigate the role of endotoxin receptor expression in the activation of hepatic stellate cells (HSCs). Methods    HSCs were isolated from normal rats and the expression of endotoxin receptors on quiet HSCs and in vitro activated HSCs was determined using RT-PCR and immunocytochemical staining methods. A rat model of liver fibrosis and cirrhosis was established. The expressions of CD14 and α-SMA in liver tissues were detected by immunohistochemical staining. Results    Freshly isolated HSCs had a low level of CD14 mRNA expression and no expression of TLR4 mRNA was detected. The in vitro activated HSCs had increased expressions of CD14 mRNA and TLR4 mRNA and LPS up-regulated the expression of endotoxin receptors. Immunocytochemical staining showed cytoplasmic and nucleolus staining for CD14 in the cultured HSCs. LPS played a further role on CD14 protein expression. In the development of liver fibrosis, the number of CD14-positive cells in the livers was increased and these cells were distributed along the sinusoids. In the later stage of liver fibrosis, the CD14-positive cells were gathered in the fibrotic septae, which also contained α-SMA positive cells. Conclusion    The activated HSCs expressed endotoxin receptors. The endotoxin receptors may be involved in the role in which HSCs played in the inflammatory process and liver fibrosis development.

【Key words】     Liver fibrosis;    Hepatic stellate cell;    CD14;    Toll-like receptor

肝星状细胞（HSC）不仅在肝纤维化的发生、发展中具有重要作用，近年的研究显示它在介导肝脏的炎症过程中也有一定作用[1，2]。作为肝脏炎症反应的一个重要物质—革兰阴性杆菌的内毒素,也称脂多糖（LPS）,它对肝内重要的效应细胞—Kupffer细胞的作用已有深入研究[3，4]。

然而目前关于内毒素对HSC的作用机制尚不明确。已发现在Kupffer细胞、肝细胞和窦内皮细胞有内毒素受体的表达[4-6]。对HSC细胞的内毒素信号转导分子的研究鲜见报道。因此，我们检测了体内外HSC在不同时期的内毒素受体的表达情况及其与细胞功能状态的关系。

材料与方法

一、实验材料

Ⅳ型胶原酶、Nycodenz、latex beads（0.885μm）、LPS（Escherichia coli 0111:B4）为美国Sigma公司产品；DMEM培养基购自美国Gibco公司；M-MLV逆转录酶、Oligo（dT）、RNA酶抑制剂购自美国Promega公司；TaqDNA聚合酶（5U/μl）、dNTP为日本TaKaRa公司产品；兔抗鼠CD14多克隆抗体为Santa Cruze公司产品；α-SMA单克隆抗体为美国Sigma公司产品；ABC免疫组织化学试剂盒为美国Vector Lab公司产品；RT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成。Wistar大鼠，清洁级，体重250g，由上海中科院实验动物中心提供。

二、实验方法

1．正常大鼠HSC的分离和培养：采用原位酶灌注法分离HSC。10%氯胺酮麻醉大鼠后，分离出门静脉插管，注入无钙的D-Hanks液，继之以含0.05%Ⅳ型胶原酶的Hanks液100ml循环灌注。分离肝脏、剪碎，以含0.03%Ⅳ型胶原酶的消化液振荡消化，得细胞悬液，以18% Nycodenz密度梯度离心，吸取最上层界面细胞即为HSC。荧光显微镜鉴定细胞纯度为90%～95%，台盼蓝拒染试验检测细胞活率为95%以上。初分离的HSC以5×105/ml接种于6孔板中，37℃、体积分数为5% CO2的培养箱中孵育24h后，首次换液。以后每隔3～4d换液1次，至细胞生长接近80%～90%融合时传代。

2. LPS对体外HSC的作用: 取初分离培养2d和传代培养2d的HSC，去细胞培养上清液，加入含LPS（1μg/ml）的新鲜DMEM培养液，置37℃、5% CO2的培养箱孵育24h，收集细胞。

3. 逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）法检测HSC内毒素受体mRNA表达：（1）抽提细胞RNA：收集初分离培养2d、传代培养2d以及经LPS作用24h后的初分离和传代培养的HSC，以Trizol抽提细胞总RNA。（2）逆转录：采用美国Promega公司逆转录试剂盒，按操作说明进行。（3）PCR反应：CD14引物序列，上游为5′-TGAGTATTGCCCAAGCACACT-3′，下游为3′-GTAACTGAGATCCAGCACGCT-5′，产物为373bp；TLR4引物序列，上游为5′-TCATC AGTGTATCGGTGGTC-3′，下游为5′-TTTCA TCTGGATTCAAGGCT-3′，产物为560bp；β-肌动蛋白引物序列，上游为5′-GATGGTGGGTATGG GTCAGAAGGA-3′，下游为5′-GCTCATTGCCG ATAGTGATGACCT-3′，产物为630bp。15g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，采用SmartView凝胶分析程序，以β-肌动蛋白作为内参照，测定CD14、TLR4 mRNA的相对表达量。

4．细胞免疫染色检测CD14蛋白表达：将新分离的HSC接种于内置玻片的6孔板中，原代培养10d。其中3孔加入LPS（1μg/ml）后继续培养24h。取出细胞爬片，以PBS冲洗，中性甲醛液固定15min。PBS冲洗，过氧化酶阻断液阻断内源性过氧化物。正常血清封闭，滴加CD14多克隆抗体（工作浓度1∶200），4℃过夜。次日加入第二抗体及卵白素辣根过氧化物酶，DAB染色，苏木素复染后封片观察。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

5. CCl4肝纤维化动物模型制作：40% CCl4（花生油）皮下注射，首剂量为5ml/kg，以后3ml/kg，每周2次，在造模的不同阶段，即0、6周和12周处死大鼠，取肝组织，中性甲醛液固定。

6．肝组织中CD14和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组织化学染色：常规4μm石蜡切片。采用ABC法，第一抗体为兔抗鼠CD14多克隆抗体和α-SMA单克隆抗体，工作浓度为1∶200。操作流程按试剂盒说明书进行。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。DAB染色，苏木素复染、脱水、透明、封片，以出现棕黄色为阳性。

结    果

1. 体外HSC内毒素受体基因的表达：初分离的HSC表达低水平的CD14 mRNA，体外传代后HSC的CD14表达增高。初分离和传代的HSC在LPS作用下CD14 mRNA的表达进一步增加。

初分离的HSC在基础状态和LPS作用下均未检测到TLR4 mRNA表达，但体外传代后的HSC则表达TLR4 mRNA，在LPS作用下TLR4 mRNA的表达增加。见图1。

2. 细胞免疫染色检测HSC中CD14表达：经细胞免疫染色发现原代培养10d的HSC爬片可见CD14表达，阳性表达产物可见于胞质和胞核，为黄色细颗粒。在LPS作用下，HSC细胞的CD14表达增加，胞质中的着色颗粒呈褐色，见图2。 

3. 肝纤维化过程中肝组织中CD14和α-SMA的表达和分布：正常肝组织中α-SMA阳性细胞较少，多分布在小静脉周围。CCl4处理6周时在肝损伤和纤维化区α-SMA阳性细胞明显增加，12周时假小叶周围的纤维隔中有大量的强阳性表达细胞，见图3A、B、C。

正常肝组织中仅有少量CD14阳性细胞，主要位于肝窦内或中央静脉周围。CCl4处理6周时窦周阳性细胞明显增多，染色增强，尤其在血管周围，阳性细胞呈灶型聚集。12周时，假小叶内仅见少量的阳性细胞，但纤维间隔内却见大量的CD14阳性细胞，这些细胞核大质少，与纤维间隔明显相关，见图3D、E、F。

讨    论

越来越多的证据提示肠源性内毒素在肝脏炎症反应中有重要作用，这一炎症过程中的效应细胞——库普弗细胞能直接被内毒素激活，产生一系列细胞因子和反应性氧自由基[7]。然而，肝脏的炎症反应过程如何进展到肝纤维化的机制目前尚不明确。有学者认为内毒素诱导库普弗细胞分泌的介质如TGFβ和反应性氧自由基等作用于HSC使其活化，因此内毒素对HSC发挥了间接作用。也有学者认为内毒素能直接刺激HSC，或者这两种途径协同作用。

内毒素受体作为LPS的信号传导分子广泛存在于各种单核巨噬细胞中。正常肝脏的Kupffer细胞有少量内毒素受体的表达，在炎症的进展过程中内毒素受体的表达明显上调[7]。最近的研究显示，内毒素受体也能在其他类型的细胞和组织中表达。已发现肝脏的实质细胞肝细胞和肝窦内皮细胞在体内外均表达内毒素受体。

HSC是肝脏的一种非实质细胞，位于Disse间隙内，围绕在肝窦周围。HSC存在静止型和活化型两种表型，不同表型的细胞具有不同的功能和特性[8]。正常情况下，HSC处于静息状态，增殖活性很低。在各种致肝损伤因子的作用下，HSC被激活，其表型发生转变，由静息型转变为激活型。HSC表型转化是肝纤维化形成过程中的一个关键病理过程。

目前对HSC上是否存在内毒素受体的表达鲜有研究。然而，一些资料提示LPS对HSC具有间接作用，能引起HSC增殖、收缩等[9，10]，因此探讨HSC是否存在内毒素受体的表达对了解其作用机制有重要作用。在本研究中，我们采用的初分离2d和传代培养2d的HSC分别代表了静止型和体外活化的HSC。由于离体的HSC自细胞分离到传代培养过程是实验性HSC的激活过程，因此若欲反应肝纤维化形成后HSC的生物学特征或研究激活后HSC的特点，应采用培养7d以上的HSC，亦即成纤维细胞。我们发现体外培养活化的HSC表达CD14 mRNA和TLR4 mRNA，而静止型HSC仅表达低水平的CD14 mRNA，提示HSC表面内毒素受体的表达上调与细胞活化有关。在LPS的作用下，活化的HSC内毒素受体的表达进一步增加，但静止型HSC无明显变化。细胞免疫染色发现体外活化的HSC表达CD14蛋白，在LPS的作用下CD14的表达增强。在本研究中，我们未做初分离的HSC的CD14细胞免疫染色，主要是为排除混杂的Kupffer细胞和肝窦内皮细胞的干扰，而体外培养7d后，这两种细胞萎缩或死亡，HSC却伸展显著。

为进一步证实体外细胞的结果，我们同时也制作了肝纤维化和肝硬化的大鼠模型，试从体内水平进一步观察在肝纤维化的进展中HSC的表型转化和内毒素受体的表达变化。α-SMA是HSC重要的功能标志，是HSC激活的一个指标。正常肝脏中除血管平滑肌细胞外，其他肝脏细胞均无α-SMA表达，若肝脏中出现α-SMA阳性细胞，提示HSC向肌成纤维细胞转化。本研究也证实了α-SMA阳性细胞增加与肝纤维化程度一致。在肝损伤和纤维化过程中，肝内CD14阳性细胞增加，这些细胞多分布在窦周和血管周围，可能是活化的Kupffer细胞和表型转化的HSC，由于未做电镜检查不能从细胞形态上进一步区分。在假小叶形成时，CD14阳性细胞聚集于纤维隔内，与α-SMA阳性细胞分布一致，提示CD14阳性细胞可能为活化的HSC或成纤维样细胞。结合体外细胞的结果，我们推测体内活化的HSC或成纤维样细胞也表达内毒素受体，它可能在肝脏的炎症反应进展到肝纤维化过程中具有重要作用。

参  考  文  献

1 Maher JJ, Lozier JS, Scott MK. Rat hepatic stellate cells produce cytokine-induced neutrophil chemoattractant in culture and in vivo. Am J Physiol, 1998, 275(4 Pt 1): 847-853.

2 Brun P, Castagliuolo I, Pinzani M, et al. Exposure to bacterial cell wall products triggers an inflammatory phenotype in hepatic stellate cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2005, 289: 571-578.

3 Uesugi T, Froh M, Arteel GE, et al. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology, 2001, 34: 101-108.

4 Su GL, Klein RD, Aminlari A, et al. Kupffer cell activation by lipopolysaccharide in rats: role for lipopolysaccharide binding protein and toll-like receptor 4. Hepatology, 2000, 31: 932-936.

5 Liu S, Khemlani LS, Shapiro RA, et al. Expression of CD14 by hepatocytes: upregulation by cytokines during endotoxemia. Infect Immun, 1998, 66: 5089-5098.

6 Dai LL, Gong JP, Luo Y, et al. Expression of CD14 protein in liver sinusoidal endothelial cells during endotoxemia. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2002, 10: 93-96.

戴立里，龚建平，罗云,等.内毒素血症时肝窦内皮细胞脂多糖受体CD14蛋白表达的观察.中华肝脏病杂志,2002,10:93-96.

7 Luckey SW, Petersen DR. Activation of Kupffer cells during the course of carbon tetrachloride-induced liver injury and fibrosis in rats. Exp Mol Pathol, 2001, 71: 226-340.

8 Eng FJ, Friedman SL. Fibrogenesis I. New insights into hepatic stellate cell activation: the simple becomes complex. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2000, 279: G7-G11.

9 Gandhi CR, Uemura T, Kuddus R. Endotoxin causes up-regulation of endothelin receptors in cultured hepatic stellate cells via nitric oxide-dependent and -independent mechanisms. Br J Pharmacol, 2000, 131: 319-327.

10 Inagaki H, Suzuki T, Oishi T, et al. Induction of hepatic stellate cell proliferation by LPS-stimulated peripheral blood mononuclear cells from patients with liver cirrhosis. J Gastroenterol, 2000, 35: 250-251.

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