应用RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达

【关键词】  肝炎病毒，乙型； RNA干扰； 小干扰RNA

Inhibition of HBV replication and expression by RNAi  WANG Yue, NIU Jun-qi, DING Yan-hua, WANG Feng

【Key words】     Hepatitis B virus;   RNA interference;   Small interfering RNA

【First author抯 address】   Department of Pediatrics, First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China

Corresponding author: NIU Jun-qi, Email: junqiniu@yahoo.com.cn

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默（PTGS）过程中，与双链RNA有同源序列的单链RNA（如mRNA）被降解，从而阻断基因表达[1，2]。RNAi过程的关键是由双链RNA切割产生21～23个核苷酸长的小干扰RNA（siRNA），从而由siRNA介导对靶mRNA特异性的降解[3]。随着制备小干扰RNA（siRNA）的技术进步，RNAi用于抑制病毒感染的研究也取得一定进展，包括脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒以及流感病毒等在内的病毒感染均可被特异性双链RNA抑制其复制和表达[4-11]。为探讨应用特异性siRNA抗乙型肝炎病毒（HBV）感染的可能性，针对HBV preC/C区和S区基因序列，设计合成HBV特异性siRNA 表达框架体系（SECs），转染HepG2.2.15细胞，观察产生的siRNA对HBV DNA表达和HBV抗原表达水平的抑制作用。

一、材料与方法

1. 材料：IMEM为美国Gibco公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司产品，G418为美国Gibco公司产品，Taq耐热DNA聚合酶为美国Promega公司产品，LineSilenceTM RNA干扰试剂盒为美国Aelle公司产品，聚合酶链反应（PCR）产物纯化试剂盒Wizard PCR Preps DNA Purification System试剂盒为美国Promega公司产品，脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000为美国Invitrogen公司产品，非放射性乙型肝炎病原基因诊断试剂盒为上海医科大学预防医学研究所产品。

2. 方法：（1）HepG2.2.15细胞的培养：HepG2.2.15细胞在含10%胎牛血清的IMDM培养基中（含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，G418 380μg/ml），37℃，体积分数5% CO2培养。2～3d更换培养液，5～6d细胞汇流传代。（2）siRNA表达框架体系的构建（采用LineSilenceTM RNA干扰试剂盒）：CR制备的siRNA表达框架体系是由聚合酶链反应（PCR）得到线性质粒载体做为siRNA表达模板，包括一个RNA介导的U6聚合酶Ⅲ启动子，一段siRNA或shRNA序列，一个RNA polⅢ终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需克隆到载体中。HBV ayw1亚型的C区2021～2041和2188～2210位点和S区308～328和458～478位点核苷酸碱基序列为靶序列，设计合成4对HBV特异性SECs的下游引物分别用于正义和反义siRNA的转录，引物序列为（划线部分为靶序列或其互补序列）：

PS1a 5′-caaaaactgtaaaaaaattcgcagtccc caacctggtgtttcgtcctttccac aaga-3′；PS1b 5′-caaaaactgtaaaaaaggttggggactgcgaattgg tgtttcgtcctt tccacaaga-3′；PS2a 5′-caaaaac tgtaaaaaggtatgttgcccgtttgtc  ggtgtttc gtcctttccacaaga-3′；PS2b 5′-caaaaactgtaaa aagacaaacgggcaacatacc ggtgtttcgtcctttccacaaga-3′；PC1a 5′-caaaaactgtaaaaagcct tagagt ctcctgagcggtgtttcgtcctttccaca aga-3′；PC1b 5′-caaaaactgtaaa aagctc aggagactctaaggcggtgtttcgtcctttccacaaga-3′；PC2a 5′-caaaaactgtaa aaagttcaggcaactcttgtgg ttggtgtttcgtcctttccacaaga-3′；PC2b 5′- caaaaa ctgtaaaaaaaccacaagagttgcctgaac ggtgtttcgtcctttccacaaga-3′。同时针对一个无关随机序列设计合成下游引物，来构建随机对照的SECs，引物序列为：5′-caaaaactgtaaaaaggtgcttgtgtatcac acgggtgtttcgtcctttccacaaga-3′；5′-caaaa actgtaaaaacgtgtgatacacaagcaccggtgtttc gtcctttccacaaga-3′。RNA干扰试剂盒提供通用模板和通用上游引物，PCR反应条件：94℃ 30s，72℃ 90s，40个循环。将正义和反义PCR产物混合后纯化。将针对靶序列S2的siRNA表达框架体系的混合纯化后线性质粒载体称为SECs-S2，针对其他靶序列及无关随机对照序列的混合纯化线性质粒载体分别称为SECs-S1、SECs-C1、SECs-C2和SECs-CON。（3）siRNA抗HBV活性检测：转染：按Invitrogen产品说明书提供的方法，用LipofectamineTM2000介导转染。转染前24h接种HepG2.2.15细胞于24孔板，1.5×105/孔，500μl/孔，次日细胞达30%～50%汇流时进行转染。将纯化PCR产物与脂质体按1μg∶3μl的比例转染细胞。仅转染PCR产物未使用脂质体的细胞作为对照组。每个产物设3个复孔。抗原检测：转染后不同时间用美国雅培公司AXSYM自动免疫分析仪及微粒子酶免分析法（MEIA）诊断试剂盒检测培养液上清中的乙型肝炎e抗原（HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。结果用S/N值（实验孔吸光度值/阴性对照孔吸光度值）表示，按下式计算siRNA对HBeAg和HBsAg的抑制率。HBeAg抑制率=（实验孔S/N-对照孔S/N）/（对照孔S/N-1.0）×100%。HBsAg抑制率=（实验孔S/N-对照孔S/N）/（对照孔S/N-2.0）×100%。HBV DNA检测：将转染后不同时间的细胞培养孔中的培养液吸出，用磷酸盐缓冲液漂洗细胞，制备细胞裂解液，按试剂盒说明进行检测。（4）细胞毒性试验：观察不同浓度PCR产物以脂质体转染细胞后，细胞的生长、形态、活细胞比例等指标。（5）统计学分析：所有数据以x-±s表示，由Excel软件处理，两组间配对t检验得出P值。

二、结果

1. siRNA对培养细胞中的HBV DNA复制的影响：SECs-S2和SECs-CON转染HepG2.2.15细胞后96h以斑点杂交法检测细胞裂解液中的HBV DNA含量变化。同对照孔细胞相比，SECs-S2转染细胞的HBV DNA水平明显下降，SECs-CON转染细胞的DNA水平轻度下降。随着浓度增大，SECs-S2对HBV DNA分泌水平的抑制作用逐渐增加，4ng/μl的浓度有最大的抑制效应（图1）。

2. siRNA对病毒抗原分泌的抑制作用：（1）siRNA对病毒蛋白表达的特异性抑制作用：SECs-S1、SECs-S2、SECs-C1均使培养液中的HBeAg和HBsAg分泌水平不同程度下降，转染后第6天SECs-CON、SECs-S1、SECs-S2、SECs-C1对HBeAg分泌的抑制率分别为8.36%、62.25%、66.80%、58.39%（后三者与SECs-CON相比，P<0.01），对HBsAg分泌的抑制率分别为10.25%、82.69%、87.49%、78.83%（后三者与SECs-CON 相比，P<0.01）。其中SECs-S2对蛋白表达的抑制作用最明显。SECs-C2对抗原分泌的影响很小甚至没有（图2）。Western blot检测细胞培养中的荧光素酶表达结果显示，细胞之间转染效率大致相同；同单独转染荧光素酶质粒的细胞相比，siRNA表达框架体系对荧光素酶的表达没有影响。（2）SECs-S2抑制作用的动力学改变：SECs-S2在转染后第1天即抑制细胞10.58%的HBeAg分泌，40.71%的HBsAg分泌，到转染后第5～6天达高峰，对HBeAg和HBsAg的抑制率分别为66.80%和87.49%，转染后10d仍有一定的抑制作用（图3，4）。（3）SECs-S2的剂量相关性抑制作用：抑制作用在SECs-S2 0.5～2.0ng/μl的浓度范围内表现为剂量相关性抑制，浓度越大，抑制作用越强，浓度为1.0ng/μl时HBeAg和HBsAg的抑制率分别为63.87%和88.85%，产物浓度超过2.0ng/μl后抑制作用开始下降。SECs-CON无明显抑制作用（图5，6）。

3. SECs对HepG2.2.15细胞的毒性观察：在实验范围内，siRNA-HBV和SECs-CON处理的HepG2.2.15细胞与对照组细胞在细胞生长状态、速度以及细胞形态，活细胞比例方面无明显差别。

三、讨论

HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA分子，具有逆转录病毒的特性，其3.5kb前基因组RNA既是DNA合成的模板，又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠，针对HBV某一靶位点设计的siRNA可以同时切割病毒的mRNA和前基因组RNA，从而有效阻断病毒蛋白质合成。针对HBV S区特定位点设计的siRNA表达框架体系，在细胞内高效而特异地抑制HBV基因表达，HBV DNA水平以及HBeAg、HBsAg分泌水平明显下降。抑制作用可持续10d，呈剂量相关性。

特异性靶向是RNAi技术的一大优势。实验中随机对照siRNA对HBV的复制和表达无明显抑制作用，而HBV特异性siRNA则产生显著的干扰效应，说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性。事实上靶序列上的点突变，即siRNA序列与靶序列之间有1～2bp的不互补就会使干扰效应大大降低甚至消失[12，13]。慢性HBV感染患者体内存在大量的不同准种甚至不同基因型的HBV基因组序列，这些病毒基因组碱基组成有所不同，加之HBV本身存在一定的变异率，有变异碱基存在的病毒就可以逃离特异性siRNA的基因沉默作用，选择最佳的靶位点以及联合使用2个以上针对不同基因型的不同位点的siRNA可以一定程度解决这个问题。研究中筛选出3个靶序列，其产生的siRNA具有干扰作用，其中针对S区458～478位点的SECs-S2抑制作用最明显，对抗原表达的抑制率达66.80%～87.49%。

实验所设计针对的靶序列共4个，其中，针对3个靶序列（S1，S2，C1）产生的siRNA能够产生干扰作用，但是干扰效应各不相同，而针对C2的siRNA对HBV基因表达基本无阻断作用。靶位点不同，siRNA产生的基因沉默效应也有所差异[14，15]。产生这种现象可能与RNAi的作用机制有关：RNAi在细胞内需要借助细胞中的某些成分（如RISC、Dicer等）来完成干扰过程。RISC在靶向同源靶RNA时，如果靶序列隐藏在复杂的空间结构中或者核酸上结合一些蛋白质成分使靶位点无法充分暴露，就可能影响RISC与靶基因的接近和结合。siRNA不同的序列组成能影响siRNA反义链5′末端磷酸化的效率，从而影响RISC的激活，随后的切割效率也受到影响。

siRNA表达框架体系是由PCR方法扩增siRNA表达模板，线性质粒载体直接导入细胞后在细胞内表达siRNA。siRNA表达框架体系具有操作简便、省时、省钱的优点，在HBV基因治疗研究中能够作为筛选最适siRNA的工具。实验中也发现siRNA表达框架体系的一些不足之处。这个方法的主要缺点是不能进行序列测定，PCR和DNA合成时产生的误读难以被发现。其次，siRNA表达框架体系则不能进行复制和扩增，PCR扩增用的模板、引物需要不断合成。

目前抗HBV治疗中多数药物如拉米夫定等均需要在病毒复制状态下起到抗病毒作用，而siRNA对于复制活动期和复制非活动期的病毒均有抑制作用，利用这一点至少可以考虑将siRNA作为拉米夫定等的辅助治疗手段应用于抗HBV的治疗中，可能更有利于清除病毒。

参  考  文  献

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