【关键词】 癌，肝细胞； 脱氧寡核苷酸，反义 Targeting the MDM2 gene using antisense oligonucleotide to induce cell apoptosis in human hepatoblastoma cell line HepG2 TENG Guang-ju, TENG Guang-shou, LI Bao-sen, ZOU Zheng-sheng, ZHANG Wei, ZHAO Jun, CHANG Bing-xia, TANG Yan. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Oligodeoxynucleotide, antisense 【First author抯 address】 PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China Email: guangju68@hotmail.com 鼠双微粒体2（MDM2）基因最初是从一个含有双微粒体（DM）的自发转化的BALB/3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的癌基因，编码的蛋白可以和抑癌基因蛋白p53相互作用。MDM2在多种肿瘤细胞中高表达[1, 2],在肝癌细胞HepG2中的表达是正常肝细胞的2.4倍，可能参与肝细胞癌的形成和进展，影响肝癌患者的预后[2-4]。因此，本研究针对MDM2基因应用特异反义寡核苷酸（ASO）降低HepG2细胞内MDM2基因的表达，观察其对HepG2细胞生物活性的影响，以期为肝癌的反义治疗提供新的靶点和实验依据。 一、材料与方法 1. 反义寡核苷酸的准备：抗MDM2 ASO是由第四军医大学郭万峰博士提供[1]，序列为：5′-CATGCCTGTAATCCC AGCAC-3′;无义对照序列为：5′-GCAGCCAAGCTCGCCGC GGT-3′。 2. 细胞培养及转染：人肝癌细胞系HepG2由郭万峰博士提供，将其培养于含有10％小牛血清的DMEM培养液（美国Gibco公司）中，置于 3. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测MDM2 mRNA的表达：转染72h后收集细胞，使用Trizol (美国Invitrogen公司)提取HepG2细胞的总RNA，使用ImProm-IITM逆转录系统（美国Promega公司）进行逆转录和PCR扩增，PCR引物和扩增方法见参考文献[1]。 4. Western blot检测MDM2蛋白的表达：转染72h后收集细胞，常规提取细胞总蛋白，Lowrey酚试剂法进行蛋白定量。采用标准Western blot方法进行检测。抗体分别为：MDM2第一抗体1∶500稀释（鼠抗，美国Santa Cruz公司）和β-肌动蛋白第一抗体1∶1000稀释（羊抗，美国Santa Cruz公司）；MDM2第二抗体1∶2500稀释（羊抗鼠，北京中山公司）和β-肌动蛋白第二抗体1：3000稀释（兔抗羊，北京中山公司）。 5. 细胞死亡的检测：HepG2细胞在DMEM中培养24～48h, 然后加入200nmol/L ASO在存有Lipofectin（5μg/ml）的无血清和抗生素的培养液中孵育6h，更换完全培养液。72h后收集细胞，按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛公司）操作步骤进行，在FACScalibur流式细胞仪检测，CellQuest软件进行分析。 6. MTT分析：取对数生长期HepG2细胞接种96孔板,每孔接种5×103个细胞,待达到60%的细胞融合度后, 然后加入200nmol/L ASO在存有Lipofectin (5μg/ml)的无血清和抗生素的培养液中孵育6h，然后更换完全培养液。经ASO处理48h后，每孔加入四唑复合物MTS（美国Promega公司）20μl，在 7. 统计学处理：应用SPSS10.0软件，数值以x-±s表示，应用t检验进行分析。 二、结果 1. ASO降低HepG2的MDM2基因表达水平：HepG2细胞经200nmol/L抗MDM2 ASO转染72h后，和正常对照组向比较,RT-PCR检测结果显示HepG2细胞中MDM2表达量显著降低，基因表达抑制率为68%（图1）,无义组没有显示出抑制作用；Western blot检测结果显示反义组MDM2蛋白含量明显减少，为细胞对照组的39%（图2）。无义组MDM2蛋白质含量没有明显改变。说明200nmol/L抗MDM2 ASO在mRNA和蛋白水平上降低了HepG2细胞MDM2基因的表达。 2．ASO影响HepG2细胞的生长增殖和细胞凋亡情况：经过流式细胞检测发现，HepG2细胞经200nmol/L抗MDM2 ASO转染后72h，其细胞凋亡率明显增高（图3）。与对照组2.1％±0.5％相比较，反义组细胞凋亡率22.7％±4.0％（t＝-8.84，P<0.01）和细胞坏死率14.5％±3.6％（t＝ -5.4，P<0.01）差异均有统计学意义；而无义组细胞凋亡率和细胞坏死率没有显著性变化。说明200nmol/L抗MDM2 ASO可以诱导HepG2细胞凋亡。MTT检测发现ASO可以明显抑制HepG2细胞的生长增殖，细胞增殖抑制率为63%±6%，（t＝24.7，P<0.01），而无意义组的细胞增殖抑制率为12%±3%，差异无统计学意义。说明抗MDM2 ASO可以抑制HepG2细胞的生长增殖。 三、讨论 MDM2 在人体组织中广泛表达，其过度表达与恶性转化表型有关，过表达的MDM2成瘤性很强[5，6]。Jablkowski等[2]对9例肝细胞癌患者和11例肝硬化患者p53和MDM2基因改变的研究，认为除了p53的改变外，MDM2基因的失常是肝细胞癌形成的一个重要事件。MDM2的表达和肝细胞癌患者的生存预后具有明显的相关性，Schoniger-Hekele等[3]对81例肝细胞癌患者分子标志物研究发现，低表达MDM2分子的患者（生存中位时间9.4个月）比高表达者存活时间明显延长（生存中位时间3.9个月），MDM2和肝细胞癌患者的存活具有相关性。 MDM2和p53相互作用，对p53起负调节的作用。p53是一种肿瘤抑制基因，它的激活可以导致细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡[7]。正常细胞中,野生型p53和MDM2相互作用形成一个负反馈环[8]。MDM2表达过强则可封闭p53介导的反式激活作用,使p53功能丧失,导致基因的不稳定性, 从而表现出癌基因蛋白的作用,参与肿瘤的形成。当前的研究认为，MDM2是肿瘤治疗的一个重要靶基因，反义寡核苷酸抑制MDM2表达被大量研究[9]，但是，在肝细胞癌中的研究少有报道。 基于MDM2分子在肝细胞癌形成和进展中的重要作用，本实验以200nmol/L抗MDM2 ASO作为有效剂量部分降低了HepG2细胞内MDM2基因的表达（图1，图2），发现反义组HepG2细胞的生长增殖明显延迟。流式细胞仪检测出现了明显的细胞凋亡和细胞坏死（图3）。说明MDM2是肝癌细胞生物治疗的有效靶点，抗MDM2 ASO可能为肝癌治疗的有效靶标药物。但是，对于抗MDM2 ASO在肝细胞癌中的作用机制以及在体内实验仍有待进一步研究。 参 考 文 献 1Guo WF, Lin RX, Huang J, et al. Identification of differentially expressed genes contributing to radioresistance in lung cancer cells using microarray analysis. Radiat Res, 2005, 164: 27-35. 2Jablkowski M, Bocian A, Bialkowska J, et al. A comparative study of P53/MDM2 genes alterations and P53/MDM2 proteins immunoreactivity in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res, 2005, 24: 117-125. 3Schoniger-Hekele M, Hanel S, Wrba F, et al. Hepatocellular carcinoma--survival and clinical characteristics in relation to various histologic molecular markers in Western patients. Liver Int, 2005, 25:62-69. 4Endo K, Ueda T, Ohta T, et al. Protein expression of MDM2 and its clinicopathological relationships in human hepatocellular carcinoma. Liver, 2000, 20: 209-215. 5Slack A, Shohet JM. MDM2 as a critical effector of the MYCN oncogene in tumorigenesis. Cell Cycle, 2005, 4: 857-860. 6Steinman HA, Burstein E, Lengner C, et al. An alternative splice form of Mdm2 induces p53-independent cell growth and tumorigenesis. J Biol Chem, 2004, 279: 4877-4886. 7Yee KS, Vousden KH. Complicating the complexity of p53. Carcinogenesis, 2005, 26: 1317-1322. 8Bond GL, Hu W, Levine AJ. MDM2 is a central node in the p53 pathway: 12 years and counting. Curr Cancer Drug Targets, 2005, 5: 3-8. 9Bianco R, Ciardiello F, Tortora G. Chemosensitization by antisense oligonucleotides targeting MDM2. Curr Cancer Drug Targets, 2005, 5: 51-56.
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