【关键词】 肝纤维化； 胶原； 转化生长因子β； 激动素 Effect of kinetin on expression of collagen type I, III, IV and transforming growth factor β 【Key words】 Liver fibrosis; Collagen; Transforming growth factor β; Kinetin 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: TIAN De-ying, Email: dytian@tjh.tjmu.edu.cn 激动素（kinetin）本源于植物，目前广泛应用于植物细胞的组织培养。近年来的研究发现激动素能抑制细胞的分化过程，对人的成纤维细胞具有选择性杀伤作用[1]。我们在大鼠肝纤维化模型上,结合Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及转化生长因子β1(TGFβ1)免疫组织化学探讨了激动素的抗肝纤维化作用。 一、材料与方法 1. 试验用药物及配制：激动素购自美国Sigma公司，先用数滴10%盐酸溶液使激动素完全溶解，后用双蒸水配制成0.1%的溶液，过滤除菌。四氯化碳（分析纯）购自北京精细化工厂，临用前用过滤后的中性菜籽油稀释成40%的溶液。多聚甲醛购自美国Sigma公司，用0.01mol/L硫酸盐溶液配制成4%多聚甲醛溶液，调至pH值为7.2,供心内灌注用。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原鼠抗人抗体购自中山生物技术有限公司，TGFβ1兔抗鼠抗体及相应第二抗体、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。 2. 动物实验和分组：Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重（200±20）g，由本校实验动物中心提供。随机分为3组：模型组，雌雄各10只，40%四氯化碳溶液每 3. 血清肝功能及肝纤维化指标检测：大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）用全自动生物化学分析仪检测；大鼠血清透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原和Ⅳ型胶原的含量采用放射免疫法检测，试剂购自上海海军医学研究所。 4. 肝脏病理学检查：大鼠肝脏标本用4%多聚甲醛溶液固定24h，脱水、透明后浸蜡、石蜡包埋，行连续切片，厚度为4μm，常规HE染色，光学显微镜检查。按《病毒性肝炎防治方案》[2]判断肝纤维化程度分期。 5. 免疫组织化学染色：石蜡切片,免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行，DAB显色。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原第一抗体为鼠抗人抗体，第二抗体为羊抗鼠抗体；TGFβ1第一抗体为兔抗鼠抗体，第二抗体为羊抗兔抗体。对各组切片随机选取5个视野，要求每个视野包含一个汇管区、一个肝小叶或一条纤维间隔，然后根据每个视野的阳性染色细胞数所占该视野细胞总数的百分比值计算其平均值为该样本的分值，用IMAGE-PRO-PLUS软件进行计分。 6. 统计学分析：数据用x-±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行t检验。 二、结果 1. 实验动物的一般情况：除对照组外的各组大鼠均出现活动、摄食、饮水减少，体重增长较慢。实验结束时，对照组20只大鼠均存活，模型组和激动素治疗组各死亡4只，雌雄均半。 2. 血清肝功能及肝纤维化指标的检测结果：激动素组和对照组的血清ALT水平分别为（57.40±17.49）U/L和（43.60±8.38）U/L，较模型组的（84.70±31.85）U/L明显降低（t值分别为3.117和5.554，P值均<0.05）。激动素组血清肝纤维化指标中Ⅳ型胶原和层黏连蛋白的含量明显低于模型组（t值分别为2.657和2.628，P值均<0.05），透明质酸和Ⅲ型前胶原含量与模型组相比，差异没有统计学意义。见表1。 3. 激动素干预后肝组织的病理学改变：肉眼观察模型组肝体积明显较正常组大，包膜紧张，表面可见颗粒状突起。激动素组与正常组肝大小几乎一致，颗粒状突起少见，包膜不紧张。HE染色镜下可见模型组存在大量肝细胞脂肪变性,呈空泡状，另有水样变性甚至气球样变,可见散在的不同程度的坏死肝细胞；在汇管区和小叶间有大量炎症细胞浸润,正常肝小叶结构遭到破坏；汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维,组织切片中有大量假小叶形成,且以小圆形为主。激动素组可见纤维程度较轻，肝小叶结构基本正常，假小叶和纤维间隔形成不明显，细胞气球样变仍明显。模型组肝纤维化程度明显高于激动素治疗组（表2）。 4. 肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原免疫组织化学染色分析：正常对照组肝脏胶原可见于汇管区和中央脉管壁,但量极少，染色较淡。模型组Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原广泛存在于纤维组织增生的汇管区、狄氏间隙,数量大,呈条索状或小片状分布,着色深，纤维间隔包绕形成假小叶。激动素治疗组Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原染色明显较模型组减少,纤维间隔染色较浅,无明显假小叶形成。见图1～3。计算各组显色指数,结果见表3，激动素治疗组与模型组比较，差异有统计学意义。 5. 肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1免疫组织化学染色分析：正常对照组TGFβ1少量表达于肝组织的间质细胞内。模型组大鼠肝组织TGFβ1表达明显增强，阳性细胞数目增多，呈棕黄色，分布于细胞质。在汇管区和纤维间隔中染色明显加深,主要见于星状细胞和炎性细胞胞质中。激动素治疗组阳性染色程度较模型组明显减轻,在纤维间隔内间质细胞和炎细胞胞质阳性染色程度减轻,阳性细胞数目减少（图4）。计算各组显色指数,结果见表3，激动素治疗组与模型组比较，差异有统计学意义 (t＝5.128，P<0.05)。 三、讨论 近年来越来越多的临床及实验证据表明肝纤维化是可逆的[3]。目前用于肝纤维化治疗的药物主要有干扰素γ、秋水仙碱、青霉胺等，但因价格和不良反应等因素，尚未能在临床上广泛应用。因而寻找新的有效药物成为当务之急。 本研究结果显示激动素能降低肝纤维化大鼠血清ALT水平和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白含量。层黏连蛋白在肝纤维化时血清中含量明显升高，与Ⅳ型胶原共同形成纤维间隔。Ⅳ型胶原浓度与肝纤维化程度有相关性，层黏连蛋白可反映晚期肝纤维化病变[4]。本组资料肝纤维化分期显示模型组中S4期为11例，明显高于激动素组的2例，提示激动素可以有效阻止晚期肝纤维化的形成。肝组织HE染色表明激动素组肝纤维化程度较轻，肝小叶结构基本正常，与模型组被大量增生的纤维间隔分隔形成大小不一的假小叶相比，其假小叶和纤维间隔形成不明显。血清学指标同肝纤维化病理组织切片反应的肝纤维化程度一致,表明激动素对实验性大鼠肝纤维化具有很好的逆转作用。 肝星状细胞（HSC）是肝纤维化形成的关键细胞[5]。HSC活化后细胞大量增殖,生成细胞外基质（ECM），以胶原成分为主。肝纤维化的形成是一个缓慢的动态过程，涉及到细胞-细胞因子-细胞外基质之间一系列复杂的反应，最终以大量的ECM合成或(和)分解为结局，因此在不同的水平抑制胶原合成是当今抗纤维化研究的一个热点。本研究通过肝组织Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原免疫组织化学显示，激动素治疗组较模型组胶原表达明显减少（P<0.05），说明激动素能够抑制Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的生成，而起到抗纤维化作用。ECM来源于肌成纤维细胞，多种细胞因子参与了激活HSC的过程。TGFβ1是一类多功能生长因子，在HSC中可形成自分泌循环，维持自身活化状态，能使单个细胞胶原合成增加60%～80%，被认为是肝纤维化形成的关键因子[6]。TGFβ1不仅提高Ⅰ型前胶原的含量，也提高Ⅲ、Ⅳ型前胶原的含量[7]。本研究结果表明在四氯化碳诱导的实验性肝纤维化模型鼠中TGFβ1的表达增加。除了增加ECM合成外,TGFβ1还通过抑制基质胶原酶的产生并提高基质金属蛋白酶抑制剂-1的产生来抑制ECM降解。所以,TGFβ1是一个重要的促纤维化介质,因而抑制其活性是一个有效的治疗靶标。本研究结果显示,激动素治疗组TGFβ1的表达量明显低于模型组,提示激动素降低Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原生成可能是通过下调TGFβ1的表达而实现的。推测激动素抗肝纤维化的机制可能为抑制HSC活化与增殖,促进ECM的降解从而达到促进Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的降解和拮抗TGFβ1的生成。证实这一点尚需更进一步的研究。 参 考 文 献 1Hsiao G, Shen MY, Lin KH, et al. Inhibitory activity of kinetin on free radical formation of activated platelets in vitro and on thrombus formation in vivo. Eur J Pharmacol, 2003, 465: 281-287. 2Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology and Chinese Society of Hepatology of Chinese Medical Association. The programme of prevention and cure for viral hepatitis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000, 8: 324-329. 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志,2000,8:324-329. 3Murphy FR, Issa R, Zhou X, et al. Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition: implications for reversibility of liver fibrosis. J Biol Chem, 2002, 277: 11069-11076. 4Gu SW, Zhang H, Zhang L,et al. Relationship between serum fibrosis markers and fibrosis quantitative analysis of liver tissue. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 1999, 7: 199-200. 顾生旺,张泓,章廉,等.肝组织纤维化分期的纤维定量分析与血清肝纤维化标志物关系的研究.中华肝脏病杂志,1999,7:199-200. 5Pinzani M, Marra F, Carloni V. Signal transduction in hepatic stellate cells. Liver, 1998, 18: 2-13. 6Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis. Front Biosci, 2002, 7: d793-807. 7Bachem MG, Sell KM, Melchior R, et al. Tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) and transforming growth factor beta 1 (TGF beta 1) stimulate fibronectin synthesis and the transdifferentiation of fat-storing cells in the rat liver into myofibroblasts. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol, 1993, 63: 123-130. 《中华肝脏病杂志》版权 |
