己酮可可碱对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏核因子κB信号通路及胰岛素抵抗的干预作用

    【摘要】  目的  观察己酮可可碱对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏核因子-κB（NF-κB）信号通路及胰岛素受体底物（IRS）-1、IRS-2和葡萄糖转运子2（GLUT2）表达的影响。 方法  24只SD大鼠高脂饮食饲养4周后，随机分为模型组和干预组，于实验第24周处死，并设普通饮食饲养大鼠6只作对照组。电泳迁移率分析检测肝脏NF-κB活性，Western blot检测肿瘤坏死因子（TNF）α和κB抑制蛋白α（IκBα）表达，逆转录聚合酶链反应检测肝脏IRS-1、IRS-2和GLUT2 mRNA表达。 结果  与对照组相比，模型组肝脏NF-κB和TNFα显著增加，IκBα显著降低，伴IRS-2表达显著增加；与模型组相比，干预组NF-κB和TNFα显著降低，IκBα有所增高，而IRS-2表达显著减少；肝脏IRS-1和GLUT2表达在3组之间差异均无统计学意义。 结论  己酮可可碱可能通过影响肝脏NF-κB信号通路和增加肝细胞IRS-2表达，从而有助于改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏胰岛素抵抗。

【关键词】  己酮可可碱； 脂肪肝； 核因子-κB； 受体，胰岛素； 鼠科

Effects of pentoxifylline on hepatic nuclear factor-kappa B signaling pathway and insulin resistance in nonalcoholic steatohepatitis rats induced by fat-rich diet  FAN Jian-gao, QIAN Yan, ZHENG Xiao-ying, CAI Xiao-bo, LU Yuan-shan. Center for Fatty Liver, Shanghai First People抯 Hospital, Jiaotong University, Shanghai 200080, China

Email: fattyliver2004@126.com

【Abstract】    Objective    To explore the effects of pentoxifylline (PTX) on nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway, insulin receptor substrates (IRSs) and glucose transporter 2 (GLUT2) expressions in livers in a rat model of nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Methods    Rats fed a fat-rich diet for 4 weeks were randomly allocated into two groups; the model group rats (n = 12) were fed a high-fat diet alone and the PTX group rats (n = 12) were fed a high-fat diet plus PTX (100 mg . kg-1 . d-1) in drinking water. Meanwhile, rats (n = 6) fed a standard diet from the start served as controls. All the rats were sacrificed at the end of the 24th week. Hepatic NF-κB binding activity was measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The expression of tumor necrosis factor (TNF)α and inhibitor κ B (IκBα) proteins in livers were determined by Western blot. Messenger RNA of IRS-1, IRS-2 and GLUT2 expressions were examined by RT-PCR. Results    NF-κB binding activity was higher in the model group than that in the controls, while it was lower in the PTX group compared with that in the model group. The expression of TNFα protein was markedly increased in the model group (vs. the control group) but decreased in the PTX group (vs. the model group). The expression of IκBα protein was decreased in the model group (vs. the control group) but increased in the PTX group (vs. the model group) to a certain extent. IRS-2 mRNA expression was markedly increased in the model group, and significantly decreased in the PTX group when compared with the model group (P < 0.01). Conclusions    PTX could influence NF-κB signaling pathway and IRS expression in livers of NASH rats, which might be involved in the improvement of hepatic insulin resistance.

【Key words】     Pentoxifylline;   Fatty liver;   Nuclear factor-kappa B;   Receptor, insulin;   Muridae

己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）可改善非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）患者临床症状、血清转氨酶水平和胰岛素敏感性，并能显著提高重度酒精性肝炎患者的短期生存率[1]。钱燕等[2]发现，PTX可减轻高脂饮食SD大鼠脂肪性肝炎及肝纤维化的程度。我们观察了PTX对高脂饮食NASH大鼠肝脏核因子-κB（NF-κB）信号通路以及胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS）和葡萄糖转运子2（glucose transporter 2，GLUT2）基因表达的影响，旨在探讨PTX作用的分子机制。

材料与方法

1． 主要材料：雄性SD大鼠30只，体重150g左右，购自中国科学院上海实验动物中心。己酮可可碱为德国Hoechst公司产品，批号870120A。肝匀浆谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。山羊肿瘤坏死因子（TNF）α多克隆抗体、山羊κB抑制蛋白α（inhibitor κB，IκBα）多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的马抗山羊IgG购自北京中山生物技术有限公司。核蛋白提取试剂盒购自美国Activemotif公司，电泳迁移率改变分析测定试剂盒购自美国Pierce公司，生物素化的DNA探针由上海赛百盛基因技术有限公司合成。TRIzol试剂购自美国Invitrogen生命技术有限公司。反转录系统试剂盒购自美国Promega公司。KOD-Plus DNA聚合酶购自日本Toyobo公司。聚合酶链反应（PCR）引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。

2. 实验分组：大鼠正常喂养1周后，随机分为3组。对照组6只，模型组和PTX干预组各12只。对照组以标准饲料喂养。模型组以高脂饲料（2%胆固醇＋10%猪油＋88%标准饲料）喂养。干预组在高脂饮食4周后，在饮水中加用PTX（100mg.kg-1.d-1）。实验动物于第24周处死。由肝右叶固定部位切取2块肝组织分别放入液氮和甲醛溶液中集中待测。

3. 肝脏GSH、MDA、SOD活性测定：取肝组织100mg，用等渗盐水1ml制成10%的肝匀浆，考马斯亮蓝染色法（Bradford法）蛋白质定量。按试剂盒说明化学比色法分别检测GSH、MDA含量和SOD活性。

4. Western blot法检测肝脏TNFα和IκBα蛋白表达：（1）肝组织总蛋白的抽提。取肝组织100mg，置于0.3ml全细胞裂解液中机械匀浆，4℃，冰上孵育30min，10000r/min，离心10min，收集上清液。用Bradford法测定蛋白质浓度。每个样品取50μg的蛋白质行SDS-PAGE电泳。制备10%聚丙烯酰胺分离胶，5%聚丙烯酰胺浓缩胶。在蛋白质样品中加入等体积的加样缓冲液，95℃加热变性15min。120V电压电泳，硝酸纤维膜电转移，20mA恒流1h。用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液（tris-buffered saline tween-20，TBST）封闭，作用2h。加入适当稀释度的第一抗体［TNFα 1∶200，IκBα 1∶1000，β-肌动蛋白（β-actin） 1∶500］，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10～15min。加入1∶1000 HRP标记第二抗体，37℃孵育1h。TBST洗膜3次，每次10～15min。电致化学发光分析法显色，将结果曝光于胶片上。采用Gene Genuis凝胶成像系统（美国sygene公司）在白光下扫描后，应用Genesnap/Genetools软件进行吸光度分析，以目的条带与β-actin的比值表示各组蛋白质表达水平。

5. EMSA测定NF-κB活性：抽提肝组织核蛋白按试剂盒说明进行。Bradford法测定蛋白质浓度。EMSA检测参照试剂盒说明书进行：取1μg核蛋白与2μl 10×结合缓冲液、1μl 50%甘油、1μl 100nmol/L氯化镁、1μl Poly（dI-dC）、1μl 1% NP-40裂解液、1μl生物素标记的探针（5′-CGCTTGATG AGTCAGCCGGAA-3′, 3′-GCGAACTACTCA GTCGGCCTT-5′），加去离子水共20μl，室温孵育20min，60g/L聚丙烯酰胺凝胶120V电泳2h。380mA半干转膜30min。将尼龙膜置于紫外交联仪中120mJ/cm2交联1min。封闭15min。HRP连接封闭液孵育15min。磷酸盐缓冲液洗膜5min×4。平衡液孵育5min。与化学发光液作用5min后，将结果曝光于胶片上。

6. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝脏IRS-1、IRS-2、GLUT2 mRNA表达：（1）从GenBank中查阅检测指标的mRNA全长序列，用Primer3引物设计软件设计（表1）；（2）取肝组织提取总RNA，取肝组织总RNA 1μg，使用AMV逆转录酶合成cDNA，取10×缓冲液2.5μl、25mmol/L硫酸镁1μl、2mmol/L dNTP 2.5μl、cDNA 2μl、10mmol/L引物各0.75μl、KOD-plus DNA聚合酶0.5U，去离子水加至25μl进行PCR扩增；（3）PCR产物采用15g/L琼脂糖凝胶电泳，电压90V，1×Tris-乙酸缓冲液为电泳缓冲液，行凝胶扫描和图像分析；（4）采用Genesnap/Genetools软件分析程序，以β-actin作为内参照，目的基因条带相对表达量＝目的基因条带信号密度值/β-actin条带信号密度值。

7. 统计学方法：采用t检验进行统计学处理。

结    果

1. 肝脏病理组织学改变：实验过程中各组动物均无死亡。模型组动物都呈现中度以上肝细胞脂肪变伴明显的小叶内炎症、坏死及细胞周围纤维化，病变以肝腺泡3区为主。与模型组相比，干预组肝脂肪变程度有所减轻，炎症活动指数（1.10±0.38对4.83±1.05，t＝11.57， P＝0.000）和纤维化积分（0.90±0.31对1.42±0.51，t＝3.02，P＝0.006）显著下降，差异有统计学意义。

2. 肝匀浆生物化学指标变化：与对照组相比，模型组肝匀浆GSH和SOD活性显著降低，MDA含量显著增高；与模型组相比，干预组GSH显著增高而MDA显著减少，SOD活性差异无统计学意义，见表2。

3. 肝组织NF-κB活性变化：与对照组相比，模型组NF-κB活性显著升高，而干预组较模型组显著降低，见图1。                       

4. 肝脏TNFα和IκBα蛋白表达的变化：对照组未发现TNFα表达但有IκBα蛋白表达，模型组TNFα蛋白表达显著增强而IκBα表达显著下降；与模型组相比，干预组TNFα蛋白表达显著下降，而IκBα表达有所升高（P>0.05），见图2，图3。

5. 肝组织IRS-1、IRS-2和GLUT2 mRNA表达变化：RT-PCR检测显示，与对照组相比，模型组IRS-2 mRNA表达显著减弱（0.099±0.032对0.274±0.063，t＝4.953，P＝0.003），干预组IRS-2表达较模型组显著增强（0.258±0.053对 0.099±0.032，t＝5.136，P＝0.002），接近对照组水平；肝脏IRS-1和GLUT2 mRNA的表达在3组之间差异无统计学意义。

讨    论

NF-κB作为一种重要的前炎症基因的转录调控子，在肝组织的炎性反应、氧化应激、肝细胞凋亡和再生中发挥着重要作用[3]。本研究结果显示，高脂饮食诱导的NASH大鼠肝脏NF-κB活性增强，伴TNFα表达显著增加，肝脏脂质过氧化物终产物MDA含量显著增加，而抗氧化及清除氧自由基的GSH和SOD活性明显降低。TNFα与活性氧、脂质过氧化物均可诱导NF-κB活化，NF-κB的活化又可促使TNFα和氧应激增加，诸因素之间互相促进，导致肝组织炎症发生和发展。

PTX除了改善血液流变学与对血小板的作用外，还有很强的抗炎、抗氧化和免疫调理作用。最近的一项临床研究显示PTX对NASH的治疗作用，共18例经组织学证实为NASH且治疗前血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平持续增高的男性患者接受为期6月PTX（400mg，3次/d）治疗。结果显示，患者的乏力症状显著改善，平均天冬氨酸氨基转移酶和ALT水平显著下降。ALT在PTX治疗1月后即显著下降，治疗3月进一步降低，60%的患者6月后恢复正常；研究还发现，治疗后NASH患者稳态模型的胰岛素抵抗指数（HOMA insulin resistance, HOMA-IR）显著改善，伴血清TNFα水平显著下降。该研究提示PTX可能通过抑制TNFα改善胰岛素抵抗（IR），从而使NASH患者在短期内获得显著临床和生化改善[1]。PTX作为一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，能阻断cAMP转变为AMP，引起细胞内cAMP浓度升高, 从而抑制细胞TNFα基因转录。另外，PTX可抑制内毒素诱导的NF-κB活化[4]。Lee等[5]研究显示PTX通过干扰氧化应激放大系统，以及抑制NF-κB和c-myb的激活来阻断肝星状细胞活化。本研究通过观察PTX对高脂饮食NASH大鼠的干预作用，结果发现肝组织TNFα表达、MDA含量和NF-κB活性显著下降，而肝脏GSH含量显著增加，这些变化均可使NASH组织学及肝功能损害得到改善。

IR是非酒精性脂肪性肝病发病机制的中心事件。目前认为，NASH的IR持续进展主要与两个机制有关，即肝脏对胰岛素廓清减低及慢性IκB激酶（IKK）β激活。TNFα和氧应激通过激活IKKβ使NF-κB抑制蛋白（IκB）降解，从而活化NF-κB，IKKβ-TNFα循环的自身增强促进IRS、磷脂酰肌醇-3激酶信号障碍和慢性氧应激等损害[6]。本研究结果显示，NASH模型组IκB表达显著降低，说明其降解增加，提示IKKβ激活，而PTX干预组IκB降解较模型组减轻，提示PTX在一定程度上具有抑制IKKβ活化的作用，理论上可能改善外周组织及肝脏对胰岛素的敏感性。

NASH时肝脏IR的机制尚未明确。研究显示IRS-1和IRS-2在胰岛素通过其特异性受体发挥生理效应上起重要作用。在胰岛素代谢效应方面，促进肌肉和脂肪组织摄取、利用葡萄糖，以IRS-1为主，IRS-2为次； 而促进肝脏糖原合成和抑制肝葡萄糖输出方面，则以IRS-2为主，IRS-1为次。肝脏葡萄糖转运则是通过肝细胞膜上GLUT2进行的。因此，在本实验中，我们通过RT-PCR检测肝组织IRS-1、IRS-2和GLUT2的表达改变，仅发现IRS-2 mRNA表达在高脂饮食NASH模型组肝脏显著降低，PTX干预可有效提高IRS-2表达，使其基本恢复正常。

由于单纯通过检测血糖、胰岛素、游离脂肪酸等指标，难以准确反映外周组织对胰岛素的敏感性，且不能评估肝脏IR，故本次实验没有对这些指标进行检测。我们既往研究发现SD大鼠高脂饮食36周时才出现HOMA-IR升高。事实上，应用正常血糖高胰岛素钳夹技术发现Wistar大鼠在高脂饮食喂养8周时就可能已发生IR[10]。对高脂饮食NASH大鼠肝脏IR进行评价以及探讨PTX对IR的直接作用及其机制将是我们下一步研究的方向。

参  考  文  献

1Satapathy SK, Garg S, Chauhan R, et al. Beneficial effects of tumor necrosis factor-alpha inhibition by pentoxifylline on clinical, biochemical, and metabolic parameters of patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol, 2004, 99: 1946-1952.

2Qian Y, Fan JG, Zheng XY, et al. Protective of pentoxifylline in nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis in rats induced by fat-rich diet. Ganzang, 2005, 10: 136-137.

钱燕,范建高,郑晓英,等．己酮可可碱对高脂饮食大鼠脂肪性肝炎并肝纤维化的干预作用.肝脏,2005,10:136-137．

3Ribeiro PS, Cortez-Pinto H, Sola S, et al. Hepatocyte apoptosis, expression of death receptors, and activation of NF-kappaB in the liver of nonalcoholic and alcoholic steatohepatitis patients. Am J Gastroenterol, 2004, 99: 1708-1717.

4Ji Q, Zhang L, Jia H, et al. Pentoxifylline inhibits endotoxin-induced NF-kappa B activation and associated production of proinflammatory cytokines. Ann Clin Lab Sci, 2004, 34: 427-436.

5Lee KS, Cottam HB, Houglum K, et al. Pentoxifylline blocks hepatic stellate cell activation independently of phosphodiesterase inhibitory activity. Am J Physiol, 1997, 273: G1094-1100.

6Medina J, Fernandez-Salazar LI, Garcia-Buey L, et al. Approach to the pathogenesis and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Diabetes Care, 2004, 27: 2057-2066.

7Chen SQ, Liu Q, Sun H, et al. Establishing a rat insulin-resistant fatty liver model. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 105-108.

陈世清,刘杞,孙航,等.脂肪肝胰岛素抵抗大鼠模型的建立.中华肝脏病杂志,2005,13:105-108．

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