【关键词】 瘦素； 瘦素受体； 癌，肝细胞 A preliminary study of the relationship between leptin and its receptor and primary hepatocellular carcinoma SHEN Lei, ZHOU Jing, LEI Wei, WEI Yun, SHEN Zhi-xiang, LUO He-sheng. 【Key words】 Leptin; Leptin receptor; Carcinoma, hepatocellular 【First author抯 address】 Department of Gastroenterology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, 430060, China Corresponding author: ZHOU Jing, Email: nancyreynord@tom.com 原发性肝细胞性肝癌是严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤。肝癌组织以及肝癌细胞株是否存在瘦素及瘦素受体的表达是认识瘦素是否参与肝癌发病机制的基础。本研究采用免疫组织化学的方法检测原发性肝细胞性肝癌及其癌旁组织中瘦素及瘦素受体蛋白的表达，并以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量分析人肝细胞癌细胞株SMMC-7721和人正常肝细胞株L02中瘦素及瘦素受体mRNA的表达，旨在为进一步探究瘦素系统与原发性肝细胞性肝癌的关系奠定基础。 一、资料与方法 1. 标本：选取2005年3月至2005年7月在武汉大学人民医院及湖北省肿瘤医院因原发性肝癌进行肿瘤切除的30例病例，所有病例术前均未行放、化疗，并且经2名工作20年以上的病理医师共同确诊为肝细胞性肝癌。其中低分化程度肝癌及中高分化程度肝癌各15例，同时取距离上述肝癌肿块 2. 细胞培养：人肝细胞癌细胞株SMMC-7721购自武汉大学典藏中心，人正常肝细胞株L02由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所惠赠。以上细胞株均以含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于含体积分数5% CO2的培养箱中 3. 免疫组织化学：瘦素兔抗人多克隆抗体（SC-842）和瘦素受体羊抗人多克隆抗体（SC-1834）购自美国Santa Cruze公司。链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学染色试剂盒购自中国福州Maxim Biotech公司。二胺基联苯氨显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。所有切片常规进行脱蜡、阻断内源性过氧化物酶活性、微波抗原修复以及封闭等处理，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法进行免疫组织化学染色，二胺基联苯氨显色。SC-842和SC-1834的工作液浓度均为1∶100。瘦素蛋白表达阳性的细胞为胞质着色，呈棕黄色颗粒；瘦素受体蛋白表达阳性的细胞为胞膜着色，亦为棕黄色颗粒。并按以下方法进行半定量分类：“＋”指<25%的细胞染色；“＋＋”指25%～50%的细胞染色；“＋＋＋”指50%～75%的细胞染色；“＋＋＋＋”指>75%的细胞染色。每张切片选择4个不重复的高倍视野，计算阳性表达细胞占全部细胞总数的百分比，取其均值作为该张切片的阳性表达百分比。 4. 瘦素及瘦素受体mRNA表达的检测：取对数生长期的细胞以Trizol试剂提取细胞的总RNA，以紫外/可见光分光光度计检测RNA的A260/A280值，取比值在1.8～2.0的RNA进行逆转录。以5μl总RNA作为模板，以随机六聚体引物作为引物，由美国Fermentas公司生产的辅助还原第一链cDNA合成试剂盒完成逆转录cDNA的合成。通过半定量RT-PCR，以β肌动蛋白作为内参照[1]，分别检测人肝细胞癌细胞株SMMC-7721和人正常肝细胞株L02中的瘦素以及瘦素受体的mRNA表达水平。β-肌动蛋白引物上游5′-ACCCACACTG TGCCCATCTA-3′，下游5′-CGGAACCGCTCATTGCC-3′，扩增片段289个碱基；瘦素引物上游5′-GTGCGGATTCTT GTGGCTTT-3′，下游5′-GGAATGAAGTCCAAACCG GTG-3′，扩增片段174个碱基；短型瘦素受体引物上游5′-TT GTGCCAGTAATTATTTCCTCTT-3′，下游5′-AGTTGG CACATTGGGTTCAT-3′，扩增片段200个碱基；长型瘦素受体瘦素引物上游5′-TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT-3′，下游5′-CTGATCAGCGTGGCGTATTT-3′，扩增片段439碱基。取3μl cDNA，5μl缓冲液，25mmol/L MgCl2 4μl，10mmol/L dNTP 1μl，25pmol各引物，1U Taq DNA聚合酶，以高压双蒸水补足体积至50μl，置于MG96+型聚合酶链反应扩增仪（中国上海Long Gene公司生产）。反应条件： 5. 统计学分析：应用SPSS10.0统计软件对数据进行处理，采用计数资料的χ2检验和计量资料的t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。 二、结果 1. 原发性肝细胞性肝癌及癌旁组织中瘦素及瘦素受体蛋白的免疫组织化学染色，棕黄色颗粒为阳性表达，见图1～4。 2. 人肝细胞癌细胞株SMMC-7721和人正常肝细胞株L02中均存在瘦素及瘦素受体mRNA的表达：见图5。 3. 原发性肝细胞性肝癌组织中瘦素及瘦素受体蛋白的表达高于相应的癌旁组织，两者差异有统计学意义，见表1。 4. 瘦素及瘦素受体蛋白在不同分化程度原发性肝细胞性肝癌组织中的表达比较，均差异无统计学意义，见表2。 5. 瘦素及瘦素受体蛋白的表达与原发性肝细胞性肝癌TNM分期无关，两者在TNM分期中各期的表达差异无统计学意义，见表3。 6. 人肝细胞癌细胞株SMMC-7721中瘦素、短型瘦素受体及长型瘦素受体的mRNA相对表达水平分别为0.819±0.069、0.428±0.031、0.308±0.027，均较人正常肝细胞株L02的表达水平（0.654±0.055、0.374±0.028、0.217±0.019）高，其差异均具有统计学意义（t值分别为4.58、3.17、6.75，P值均<0.01）。 三、讨论 瘦素受体是一种单跨膜的细胞表面受体，属于I类细胞因子受体家族，按其细胞内片段长度及氨基酸序列组成的差异主要分为短型瘦素受体和长型瘦素受体。随着研究的深入，发现瘦素的功能并不局限于此，他对胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素和性激素等的分泌均具有调节功能，在糖代谢、生长发育、生殖功能等的调控中也发挥重要作用。作为一种生长因子，瘦素能促进食管癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病以及脂肪细胞分化的恶性肿瘤中的肿瘤细胞的增殖[2-7]。此外，还有研究发现瘦素在肿瘤转移、血管生成、化疗药物耐药等方面具有重要调节作用[8-10]。 通过免疫组织化学染色，我们发现在人类的原发性肝细胞性肝癌组织以及癌旁组织中均存在着瘦素以及瘦素受体蛋白的表达，并且肿瘤组织中的瘦素以及瘦素受体蛋白的表达水平高于癌旁组织，差异具有统计学意义。提示瘦素以及瘦素受体水平的检测有可能作为区分组织良恶性的标志。但是，瘦素以及瘦素受体蛋白的表达水平在不同分化程度的肿瘤组织以及不同TNM分期的肿瘤组织中无明显差异。提示瘦素系统可能参与了原发性肝细胞性肝癌的早期过程，检测它们有可能为早期发现肿瘤提供依据。 通过半定量的RT-PCR检测，我们观察到人肝细胞癌细胞株SMMC-7721以及人正常肝细胞株L02中均存在着瘦素以及瘦素受体（包括长型受体和短型受体）mRNA的表达，并且两种细胞株都以表达短型瘦素受体为主。进一步与内参照β-肌动蛋白进行吸光度的比较，又发现瘦素以及瘦素受体mRNA的表达水平在肝癌细胞株较正常细胞株为高，两者差异有统计学意义。 综上所述，我们的研究初步发现，原发性肝细胞性肝癌组织中存在着瘦素以及瘦素受体蛋白的双重表达，并且与癌旁组织相比差异有统计学意义。同时，肝细胞癌细胞株中也存在着瘦素以及瘦素受体mRNA的双重表达，并且与正常肝细胞株相比差异有统计学意义。提示瘦素系统极有可能参与了肝细胞性肝癌的发生、发展过程，但其具体的机制以及信号通路还有待于更加深入的研究。 参 考 文 献 1Yuan SS, Chung YF, Chen HW, et al. Aberrant expression and possible involvement of the leptin receptor in bladder cancer. Urology, 2004, 63: 408-413. 2Somasundar P, 3Hardwick JC, Van Den Brink GR, Offerhaus GJ, et al. Leptin is a growth factor for colonic epithelial cells. Gastroenterology, 2001, 121: 79-90. 4Hu X, 5Stattin P, Soderberg S, Hallmans G, et al. Leptin is associated with increased prostate cancer risk: a nested case-referent study. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86: 1341-1345. 6Hino M, Nakao T, Yamane T, et al. Leptin receptor and leukemia. Leuk Lymphoma, 2000, 36: 457-461. 7Oliveira AM, Nascimento AG, Lloyd RV. Leptin and leptin receptor mRNA are widely expressed in tumors of adipocytic differentiation. Mod Pathol, 2001, 14: 549-555. 8Mareel M, Leroy A. Clinical, cellular, and molecular aspects of cancer invasion. Physiol Rev, 2003, 83: 337-376. 9Attoub S, Noe V, Pirola L, et al. Leptin promotes invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-, rho-, and rac-dependent signaling pathways. FASEB J, 2000, 14: 2329-2338. 10Beecken WD, Kramer W, Jonas D. New molecular mediators in tumor angiogenesis. J Cell Mol Med, 2000, 4: 262-269.
《中华肝脏病杂志》版权 |