【摘要】 目的 观察肝纤维化大鼠的肥大细胞（MC）数量变化和蛋白酶激活受体-2（PAR-2）在肝脏中表达及其与肝纤维化的关系。 方法 建立大鼠肝纤维化模型，以甲苯胺蓝染色显示MC，运用碱水解法测定肝脏羟脯氨酸含量，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测正常对照组及造模2、4、8、12周组大鼠肝组织中PAR-2 mRNA的表达；免疫组织化学方法检测PAR-2蛋白的表达及定位。 结果 正常对照组大鼠肝组织中MC数量极少，仅（2.5±1.0）个，主要沿肝脏汇管区分布；模型组MC数量：2周为（9.1±0.5）个，4周为（15.7±3.0）个，8周为（32.0±3.3）个。造模组2周与正常组比较，P＝0.038，造模组组间比较，F＝58.553, P<0.01，差异均有统计学意义。MC在汇管区、中央静脉周围密集分布。随着造模时间的延长，肝脏羟脯氨酸的含量逐渐升高。PAR-2 mRNA检测结果，PAR-2/β-肌动蛋白（β-actin）：正常对照组几乎不表达；造模2周肝组织可有少量PAR-2 mRNA表达，为0.15±0.01，4周为0.35±0.02，8周为0.80±0.02。PAR-2蛋白检测结果，阳性信号灰度：正常对照组为156.0±0.5；造模2周为162.5±1.3，4周为174.8±1.3，8周为185.7±2.1，12周为207.7±4.4，模型组与对照组比较和模型组组间比较，F＝429.389, P<0.01，差异均有统计学意义。 结论 PAR-2 mRNA和蛋白的表达水平与MC数量、羟脯氨酸含量的增加一致，可能在肝纤维化的发生发展过程中起重要作用。 【关键词】 肝纤维化； 蛋白激酶类; 肥大细胞 Changes of mast cells and protease activated receptor Email: xuzou@medmail.com.cn 【Abstract】 Objective To explore the quantity of mast cells and the role of protease activated receptor-2 (PAR-2) in experimental rat liver fibrosis. Methods Rats were sacrificed at 0, 2, 4, 8, and 12 weeks after subcutaneous injection of CCl4. Mast cells were displayed by toluidine blue stain. The content of liver hydroxyproline was measured by the method of base hydrolyzate. The mRNA expression and the protein expression of PAR 【Key words】 Liver fibrosis; Protein kinases; Mast cell 肝纤维化的发病机制目前仍不十分清楚，肥大细胞（mast cell，MC）直接或间接参与了纤维化疾病的病理过程[1], 推测MC这种致纤维化作用可能是分泌的类胰蛋白酶等调节因子[2,3]，通过激活肝星状细胞（HSC）膜上的蛋白酶激活受体-2（protease activated receptor-2, PAR-2）来实现的[4]，但未得到进一步证实。本实验通过观察肝纤维化大鼠肝脏中PAR-2的定位和定量及其与MC之间的关系，从而评估PAR-2的激活在肝纤维化中的作用，为进一步研究肝纤维化的发生机制提供实验依据。 材料与方法 1. 主要试剂与仪器：羊抗PAR-2多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），SP免疫组织化学试剂盒（北京中山公司），二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（华美生物工程公司），羟脯氨酸碱水解法测试盒（南京建成生物工程研究所），逆转录试剂盒（美国Promega公司），Olympus Image-Pro Version 2. 动物模型与分组：雄性SD大鼠35只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，体重(180±20) g，随机分为模型组(28只) 和对照组(7只）。模型组给予40%四氯化碳（CCl4）花生油溶液2.5ml/kg皮下注射，每周2次，连续12周。对照组给予等量的等渗盐水。分别于造模后2、4、8、12周处死动物。处死前禁食12h，戊巴比妥钠（40 ml/kg）腹腔麻醉，经下腔静脉取血备用，同时取 3. 肝组织常规HE染色及Masson胶原染色：大鼠肝组织经4%中性缓冲甲醛固定后石蜡包埋，制作4μm切片作HE及Masson染色。Masson染色步骤：切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染5～10min，盐酸乙醇分化，流水蓝化，蒸馏水漂洗，丽春红酸性品红液染5～8min，蒸馏水漂洗，1%磷钼酸染1～3min，直接入苯胺蓝液染5min，水速洗烘干，二甲苯透明，封固。胶原纤维蓝色。Masson染色切片用Olympus Image-Pro Version 4. MC染色及计数：石蜡切片脱蜡后，置于1%甲苯胺蓝溶液中15min，水洗后用1%冰醋酸进行分化，直到胞核与颗粒清晰，在显微镜下控制分化程度，水洗，烘干，透明封片。MC颗粒为红紫色，细胞核为蓝色。计数方法：切片置于光镜400倍下，每张切片随机选取5个高倍视野对MC进行计数，MC计数以平均每高倍视野的MC个数表示。 5. 肝脏羟脯氨酸测定：按照羟脯氨酸测试盒说明书Ⅵ（样品碱水解法）进行。 6. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分析：按Trizol说明书操作提取肝组织总RNA，将RNA用小鼠白血病病毒逆转录酶合成cDNA，在25μl反应体系中分别加入5U/μl的 7. PAR-2免疫组织化学定位和定量分析：采用SP法。第一抗体PAR-2用1∶50稀释，阴性对照以磷酸盐缓冲液（PBS）代替第一抗体。操作步骤：按有关试剂的产品说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，滴加3%双蒸水 50μl， 8. 统计学处理：采用SPSS11.5统计软件，组间差异显著性检验采用t检验及方差分析。对PAR-2 mRNA及蛋白的变化分别与MC数目、肝组织纤维化面积、羟脯氨酸含量进行Pearson相关分析。 结 果 1. 一般情况：在实验期间，对照组大鼠全部存活，模型组大鼠有6只死亡，死因为CCl4注射入腹腔或脏器，引起严重感染。 2. HE/Masson染色显示：正常大鼠肝脏内未见明显胶原纤维着色，模型组2周时主要见肝细胞变性坏死，胶原纤维增生不明显，肝间质中散在淡红色呈线样染色；4周时胶原纤维增生，红染的胶原纤维束分布于肝小叶中；8周时胶原纤维显著增多，可见汇管区条索状染色纤维向肝小叶内伸展，形成厚薄不一的纤维间隔分割肝小叶，局部有假小叶形成；12周时纤维间隔进一步加宽，肝组织结构完全改建。图像分析结果显示：正常肝组织中纤维面积为0.8%±0.2%，而模型组2、4、8、12周纤维组织面积分别为4.7%±0.4%、10.9%±0.9%、16.5%±0.6%和25.4%±1.2%，模型组与对照组比较和模型组组间比较，F＝926.723, P值均<0.01，差异均有统计学意义。提示肝脏纤维化程度随着造模时间的延长逐渐加重。 3. MC计数及分布特征：甲苯胺蓝染色显示，正常对照肝组织中MC数量很少，平均为（2.5±1.0）个/高倍视野（HP）, 沿汇管区分布。造模组：2周时MC 数量开始增加为（9.1±0.5）个/HP，4周时明显增多为（15.7±3.0）个/HP，8周后则显著增多为（32.0±3.3）个/HP；最多者可达正常肝组织中MC 数量的16倍。造模组2周与正常组比较，P＝0.038，造模组组间比较，F＝58.553, P<0.01，差异均有统计学意义。 MC多分布于汇管区、中央静脉周围，在肝纤维化后期还可沿纤维间隔分布。纤维化8周后，可见MC胞体增大，出现较多脱颗粒现象，见图1。 4. 肝组织羟脯氨酸在肝纤维化过程中的动态变化 见表1。 5. PAR-2 mRNA的表达：RT-PCR法扩增出长度为347bp的PAR-2片段，正常对照组中几乎检测不到PAR-2 mRNA的表达，造模2周时肝组织可有少量PAR-2 mRNA表达（PAR-2/β-actin）为0.15±0.01，4周表达增加为 0.35±0.02，，8周后维持在较高水平为0.80±0.02，造模组与正常组比较，P＝0.000，造模组组间比较，F＝358.618, P<0.01, 差异有统计学意义，见图2。 6. PAR-2免疫组织化学定位和定量：PAR-2蛋白在肝组织中表达的阳性反应产物呈棕黄色，分布于细胞质内。最早出现于窦内皮细胞和血管内皮细胞的细胞质，后逐渐出现于HSC、汇管区纤维细胞和肝细胞等细胞质中，见图3。PAR-2蛋白在肝组织中表达水平见表2。 7. 相关性分析：肝组织中PAR-2 mRNA及蛋白的表达和MC数目、羟脯氨酸含量均在肝纤维化过程中呈递增趋势。PAR-2 mRNA与胶原纤维面积比、MC数目、羟脯氨酸含量均呈正相关，r分别为0.95、0.94、0.90，P值均<0.01；PAR-2蛋白的阳性染色信号灰度与胶原纤维面积比、MC数目、羟脯氨酸含量也均呈正相关，r分别为0.99、0.92、0.91，P值均<0.01。 讨 论 Nystedt等[5]在研究鼠的cDNA文库时第一次发现了PAR-2基因，它是PARs家族成员之一，目前发现的PARs家族成员共有4个，分别为PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-1、PAR-3和PAR-4是凝血酶受体，而PAR-2为胰酶受体。PAR-2可被包括MC分泌的类胰蛋白酶和激活状态的凝血因子Ⅹ剪切激活。Gaca等[4]研究发现激活的鼠HSC转变为肌成纤维细胞时，HSC中PAR-2 mRNA及蛋白的表达一致性进行性增加。在本研究中，观察到在大鼠肝纤维化形成过程中肝组织PAR-2 mRNA和蛋白的表达。在造模2周时即可测出，以后逐渐升高，而且两者的升高经相关性分析均呈递增趋势，造模8周后检测显示PAR-2 mRNA和蛋白均维持在较高水平。PAR-2蛋白主要在HSC、汇管区成纤维细胞、窦内皮细胞等部位表达，这与纤维化形成过程时HSC增多和纤维形成的部位等相一致。随着肝纤维化的进展，肝组织PAR-2 mRNA及蛋白的表达进行性增加，而且其表达水平与肝纤维化程度相关，揭示PAR-2参与了肝纤维化的形成。 我们还动态观察了大鼠肝纤维化模型中PAR-2 mRNA及蛋白的表达与胶原纤维面积比、羟脯氨酸含量之间的关系。在造模初期，可见肝脏发生肝细胞变性坏死，胶原纤维增生，炎症细胞浸润等病理变化，随着时间推移，较厚的纤维间隔分割肝小叶，最终假小叶的形成，肝组织结构完全改建。分析显示肝脏纤维化面积逐渐增加，由造模2周时的5%到12周时的25%；反映肝脏纤维化程度的羟脯氨酸含量也由造模2周时的（149.8±21.9）μg/mg增至12周时的（386.6±17.8）μg/mg，两者相比，差异有统计学意义，表明PAR-2的表达与肝脏纤维组织面积及羟脯氨酸的含量成正相关。 在CCl4、二乙基亚硝胺、放射线、猪血清和胆管切除等诱导的各种实验性鼠肝纤维化模型中发现肝组织内有MC的增生[6, 7]，而且MC数量与肝纤维化程度呈正比，这点在我们的研究中也得以证实：正常组中MC 数量很少，在造模组2周后MC数量明显增加, 4周后逐渐增多；MC多出现于汇管区, 后期沿纤维间隔分布，在肝纤维化的后期还出现MC脱颗粒现象。Akers等[8]报道，MC激活后能够分泌过多的强力调节因子，类胰蛋白酶是MC自分泌颗粒中的一种重要调节因子，近期研究认为类胰蛋白酶可能是通过激活PAR-2来刺激纤维原细胞的胶原合成。我们从实验中观察到在肝脏纤维化形成过程中，PAR-2的表达与MC数目的变化呈正相关，推测在肝纤维化形成过程中，MC的致纤维化作用与PAR-2有关。 本研究论证了MC的增生与活化通过其分泌的类胰蛋白酶激活PAR-2后，参与了肝纤维化的形成过程，因此推测PAR-2在肝纤维化的发生发展过程中可能发挥重要作用。对于在肝纤维化中是否仅有MC分泌的类胰蛋白酶才能激活PAR-2以及PAR-2被激活后怎样引起下一步信号传导等问题则有待于今后进一步研究。 参 考 文 献 1Stoyanova II. Relevance of mast cells and hepatic lobule innervation to liver injury. Rom J Gastroenterol, 2004, 13: 203-209. 2Li CY, Baek JY. Mastocytosis and fibrosis: role of cytokines. Int Arch Allergy Immunol, 2002, 127: 123-126. 3Frungieri MB, Albrecht M, Raemsch R, et al. The action of the mast cell product tryptase on cyclooxygenase-2(COX2) and subsequent fibroblast proliferation involves activation of the extracellular signal-regulated kinase isoforms 1 and 2(erk1/2). Cell Signal, 2005, 17: 525-533. 4Gaca MD, Zhou X, Benyon RC. Regulation of hepatic stellate cell proliferation and collagen synthesis by proteinase-activated receptors. J Hepatol, 2002, 36: 362-369. 5Nystedt S, Emilsson K, Wahlestedt C, et al. Molecular cloning of a potential protease activated receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91: 9208-9212. 6Jeong DH, Lee GP, Jeong WI, et al. Alterations of mast cells and TGF-beat1 on the silymarin treatment for CCl(4)-induced hepatic fibrosis. World J Gastroenterol, 2005, 11: 1141-1148. 7O扠eeffe C, Baird AW, Nolan N, et al. Mast cell hyperplasia in chronic rejection after liver transplantation. Liver Transpl, 2002, 8: 50-57. 8Akers IA, Parsons M, Hill MR, et al. Mast cell tryptase stimulates human lung fibroblast proliferation via protease-activated receptor-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000, 278: L193-201.
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