应用shRNA研究乙型肝炎病毒X基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞p53表达和活性的影响

    【摘要】  目的  应用短发夹状RNA介导的RNA干扰研究乙型肝炎病毒X基因（HBX）和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞p53表达和活性的影响。 方法  以2μmol/L As2O3处理HepG2细胞和表达HBX的HepG2-X，以未处理细胞为对照，提取细胞裂解物或胞核裂解物，采用改进的酶联免疫吸附法检测p53总量和相对活性吸光度。应用脂质体介导具有HBX序列特异性短发夹状RNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3转染HepG2-X，再次观察As2O3处理对p53表达和活性的影响。 结果  As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性。短发夹状RNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。 结论  As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。应用短发夹状RNA介导的RNA干扰有利于研究HBX的表达对p53表达和活性的影响。HBX表达上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性。

【关键词】  肝炎病毒，乙型； RNA干扰； p53蛋白质； 三氧化二砷； 基因，X

Study of effects of HBV X gene and As2O3 on expression and activity of p53 in HepG2 cells with shRNA   HE Xing-e, LEI Jian-hua, YANG Xu, WANG Wen-long, LUO Hong-yu, LIAN Jun. Liver Disease Research Center, Second Xiangya Hospital, Central-South University, Changsha, 410011, China

Corresponding author: LEI Jian-hua, Email: leijianhua73@yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To delineate the effects of HBV X gene and of As2O3 on p53 expression and activity in HepG2 cells by shRNA-mediated RNA interference (RNAi). Methods    HepG2 cells and cells with stable expression of HBV X gene, HepG2-X, were treated with 2μmol/L As2O3, and the corresponding untreated cells were used as controls. Cell and nuclear lysates were extracted. Total level and the relative activity absorbance of p53 were detected by modified ELISA. HBV X gene sequence-specific shRNA expression vectors, Xi-S1 and Xi-S2, and sequence-unrelated control Xi-S3 were transfected into HepG2-X. The effect of As2O3 on p53 expression and activity were retested. Results    Total p53 level was up-regulated and its relative activity ratio was enhanced by As2O3 in HepG2 and HepG2-X cells. The total p53 level induced by As2O3 was further up-regulated by HBX expression, while its relative activity was significantly suppressed. The suppression was removed after HBX expression was suppressed by shRNA. Conclusion    As2O3 could up-regulate p53 expression and enhance its activity. shRNA-mediated RNA interference is conveniently being used in studies on the effect of HBV X gene expression on p53 expression and activity. HBV X expression could up-regulate p53 gene expression level induced by As2O3, while it suppressed the activity of p53.

【Key words】     Hepatitis B virus;   RNA interference;   Protein p53;   Arsenic trioxide;   Genes, X

p53是一种转录调节因子，与肿瘤细胞周期和细胞凋亡密切相关。慢性乙型肝炎（HBV）感染特别是乙型肝炎病毒X基因（HBX）的表达是原发性肝细胞癌（HCC）的高危因素，研究表明其与p53的表达和活性关系密切[1-6]。低浓度三氧化二砷（As2O3）可诱导多种肿瘤细胞凋亡，其机制可能与p53等多种凋亡相关蛋白有关[7-11]。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是使目的基因沉默表达的有效方法[12-14]，我们拟应用短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）介导的RNAi研究HBV X基因表达和As2O3对HepG2细胞p53表达和活性的影响。

材料与方法

1. HepG2细胞和表达HBX的细胞：HepG2-X（表达HBX的HepG2细胞）由中南大学湘雅二医院肝病研究所保存，培养于含体积分数10%新生牛血清的DMEM中，培养条件为37℃、体积分数为5% CO2，后者加入100μg/ml潮霉素B。DuoSet IC Human Total p53和Human/Mouse Active p53酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒均为美国R&D公司产品，显色底物为美国KPL公司的0.4g/L四甲基联苯胺(溶于有机基质)和0.02%过氧化氢(溶于柠檬酸缓冲液)；PureFection Plasmid DNA Purification System购自美国Promega公司；转染试剂Lipofectamin 2000为美国Invitrogen公司产品；小鼠抗HBX（1.7×104/2.8×104）单克隆抗体为英国Serotec公司产品；β-肌动蛋白（actin）（4.3×104）单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品；First Strand cDNA Synthesis Kit购自日本TOYOBO公司；Western blot Luminol Reagent为美国Santa Cruz公司产品。As2O3由湘雅二医院医学实验中心提供。

2．实验分组：将细胞分为7组，各组细胞按相同密度种板24h后完成贴壁生长，处理组加入终浓度为2μmol/L的As2O3继续培养36h，对照组除无As2O3外其余条件相同。HepG2处理组，HepG2对照组；HepG2-X处理组，HepG2-X对照组；Xi-S1转染HepG2-X 24h后处理组（HepG2-X-S1组）；Xi-S2转染HepG2-X 24h后处理组（HepG2-X-S2组）；Xi-S3转染HepG2-X 24h后处理组（HepG2-X-S3组）。

3．HBX序列特异性的shRNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3由上海生工生物工程公司合成并测序确认，具有氨苄青霉素和新霉素抗性以及冠状绿色荧光蛋白（coral green fluorescent protein，cGFP）表达标记，由本研究中心保存于菌株DH5α。Xi-S1克隆序列为5′-AGTGGATCCGTTCACCTC TGCACGTTGCATTAGTACTTGCAACGTGCAGA GGTGAATTTTTAAGCTT-3′。Xi-S2为5′-AGTGGATCCGGGTCTTACATAAGAGGACTTTA GTACTAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTAA GCTT-3′。Xi-S3为5′-AGTGGATCCGTTCCAG GATCAACAACAACTTAGTACTGTTGTTGTTGA TCCTGGAATTTTTAAGCTT-3’。

4．质粒载体的转染和阳性细胞筛选：按说明书将抽提纯化的质粒用Lipofectamin 2000转染入HepG2-X细胞，第3天充分消化后按面积1∶10将细胞接种于25cm2培养皿中，贴壁后即可在荧光显微镜下观察转染效率。用潮霉素和新霉素约3周后可筛选出绿色荧光蛋白阳性的细胞克隆，转入培养瓶中培养传代。

5．逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot鉴定HBX基因表达水平：（1）Trizol提取细胞总RNA，按第一链合成试剂盒说明书进行cDNA合成。100ng模板RNA经65℃变性15min，采用随机引物，反应条件为25℃ 10min，37℃ 50min，94℃ 15min，4℃ 5min。（2）以1μl cDNA为模版聚合酶链反应（PCR）扩增鉴定，X上下游引物序列分别为5′-ATCG GTACCATGGCTGCTAGGCTG-3′和5′-GGA GAATTCATGATTAGGCAGAGGTG-3′，内参照β-actin上下游引物序列分别为5′-TGGGTCAGAAGGA CTCCTATG-3′和5′-CAGGCAGCTCATAGCT CTTCT′-3′，4℃预变性10min，94℃ 45s，63℃ 45s，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃ 5min，凝胶电泳分析约470bp的X目的片段和约590bp的β-actin目的片段，并进行灰度分析。（3）用预冷的细胞裂解液提取细胞总蛋白，每泳道加样总蛋白50μg进行8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。（4）用聚偏二氟乙烯膜以50mA稳流湿式转膜8h，丽春红显色后按HBX和β-actin将聚偏二氟乙烯膜剪开。50g/L脱脂奶粉,体积分数为3%的牛血清白蛋白封闭1h，分别用HBX或β-actin第一抗体4℃孵育过夜，含土温20的Tris缓冲液洗涤3次，第二抗体孵育1h，含土温20的Tris缓冲液洗涤3次，加Luminol Reagent立即压感光胶片15min，洗片后拟合标准品进行鉴定。

6．总p53的测定：96孔板每孔加入100μl第一抗体（4μg/ml）包被过夜，彻底洗净后加入300μl封闭液，室温封闭2h后，彻底洗净备用；取磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次的1×107细胞加入1ml细胞裂解液R-5（现配），5min后4000×g离心5min，取上清液比色法测定蛋白质浓度，每孔加入20μg总蛋白，用IC-4（试剂盒要求的液体4∶1mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100 PBS，pH7.2～7.4）稀释至100μl；设置p53标准孔0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0pg/100μl IC-4；温育2h后洗涤3次；加入IC-4稀释成100ng/ml的生物素偶联第二抗体100μl，温育2h后充分洗涤；加入IC-4稀释成工作浓度的链亲合素偶联辣根过氧化酶100μl，温育20min后充分洗涤；加入1∶1现配制的四甲基联苯胺显色底物100μl，温育20min；加入50μl配制的0.5mol/L硫酸终止液，轻拍混匀，立即在450nm处测吸光度（A）值（以A570值为本底），计算p53的表达量。各组细胞重复实验13次。

7．p53相对活性比测定：96孔板每孔加入100μl第一抗体（1μg/ml）包被过夜，彻底洗净后加入300μl反应液，温育2h后，彻底洗净备用；取PBS洗涤1遍的2.5×106细胞加入1ml细胞裂解液A（现配），5min后16000×g 4℃离心5min，弃上清液，加入25μl细胞裂解液B（现配），涡转10s后冰浴20min，16 000×g 4℃离心5min，取上清液，比色法测定蛋白质浓度；取20μg总蛋白，加入3μl标记有生物素的序列特异性寡核苷酸，用裂解液B稀释至30μl为1个反应体系，温育30min；同时设置仅标记有生物素的序列特异性寡核苷酸的体系为空白对照，20μg总蛋白加入3μl并未标记有生物素的序列特异性寡核苷酸的体系为特异性确认孔，同样用裂解液B稀释至30μl；每个体系加入反应液200μl，混匀，按每孔100μl加入孔板中，温育2h后洗涤5次；加入反应液稀释成工作浓度的链亲合素偶联辣根过氧化酶100μl，温育20min后充分洗涤；加入1∶1现配制的四甲基联苯胺显色底物100μl，温育20min；加入50μl配制的0.5mol/L硫酸终止液，轻拍混匀，立即在450nm处测A值（以A570值为本底），代表p53的相对活性比。各组细胞重复实验8次。

8．统计学分析：数据处理应用SPSS软件完成，分析各组数据方差齐性后，方差分析或Kruskal-Wallis H检验进行均数比较，必要时Tamhane’s T2或Turky两两比较。

结    果

1．测序证实pRNAT-U6.1/Neo克隆3个shRNA表达质粒Xi-S1、Xi-S2、Xi-S3均重组成功。

2．Xi-S1、Xi-S2、Xi-S3转染细胞约3周后，均筛选出耐潮霉素和新霉素的cGFP细胞克隆，传代培养后cGFP稳定表达，分别命名为HepG2-X-S1、HepG2-X-S2和HepG2-X-S3（图1）。    

3．RT-PCR HBX表达水平：RT-PCR均成功扩增出约470bp的目的片段，但与内参照β-actin 590bp目的条带比较，序列特异性Xi-S1、Xi-S2转染组HBV X基因的表达受到抑制，并且以前者明显。序列无关对照Xi-S3则对HBX的表达水平无影响（图2）。

4. Western blot分析HBX蛋白质表达水平：Western blot均成功显影出相对分子量1.7×104的目的条带，并且在约2.8×104处有隐约条带，与内参照β-actin 4.3×104目的条带比较，序列特异性Xi-S1、Xi-S2转染组HBX蛋白质表达受到抑制，并且以前者明显。序列无关对照Xi-S3则对HBX表达水平无影响。抑制主要见于1.7×104条带，2.8×104条带则无差别（图3）。

5．HepG2和 HepG2-X细胞经As2O3处理36h后细胞p53水平和p53相对活性比（A450～A570）比较见表1。（1）HepG2细胞As2O3处理36h后总p53水平和p53相对活性比均显著升高（t值分别为2.418和3.696，P值均＜0.01）。同样，HepG2-X细胞As2O3处理36h后p53相对活性比显著升高（t＝2.585，P＝0.017），总p53水平也有升高趋势（t＝1.156，P＝0.256）。（2）未予As2O3处理的HepG2和HepG2-X细胞p53水平差异无统计学意义（t＝1.327，P＝0.197），但HepG2-X的p53相对活性比显著下降，差异无统计学意义（t＝2.049，P＝0.060）。（3）As2O3处理36h后，HepG2-X的p53水平较HepG2有所升高（t＝2.263，P＝0.033），但p53相对活性比显著下降（t＝6.537，P＝0.000）。

表1  HepG2和HepG2-X细胞p53水平及其

相对活性比变化（x-±s）

组别                总p53*(×10-4)       P53相对活性比＃

HepG2处理组          34.04±2.52          0.46±0.05

HepG2对照组          32.22±2.93          0.32±0.02

HepG2-X处理组        37.65±5.17          0.33±0.03

HepG2-X对照组        33.62±2.41          0.29±0.04

  注：* F＝5.856，P＝0.002；＃ F＝34.390，P＝0.000

6.不同HBX表达水平的细胞经As2O3处理36h后细胞p53水平和p53相对活性比比较见表2。HepG2-X经As2O3处理36h后的p53水平最高，而HepG2-X-S1组和HepG2-X-S2组总p53水平与HepG2水平相当。相反，HepG2-X经As2O3处理36h后的p53相对活性比最低，而HepG2-X-S1组和HepG2-X-S2组的p53相对活性比与HepG2处理组水平相当，HepG2-X-S3组则与HepG2-X处理组相当。

讨    论

HBX蛋白由HBV X基因编码，具有广泛的细胞基因反式激活作用，并且能引起哺乳动物细胞体外转化或转基因后诱导小鼠HCC变[1，2]。p53基因是一个重要的抑癌基因，活化的p53蛋白能促进细胞凋亡和修复损伤的DNA，许多肿瘤与p53基因的多种失活突变有关[3-6]。

As2O3对许多肿瘤细胞具有明显的生长抑制及诱导凋亡作用，并与p53基因表达水平上调有关[7-11]。本研究结果表明As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强，说明As2O3可用于HCC包括HBX相关的HCC的治疗。本研究在此基础上，分析了HBX表达对As2O3诱导HepG2和HepG2-X细胞p53水平和活性的影响。

在本研究中引入了RNAi技术，结果表明设计的不同shRNA可使HBX表达呈现不同水平，序列特异性的shRNA对HBX表达水平具有明显的抑制作用，从而便于进一步分析HBX表达与p53水平和转录调节活性的关系。本研究结果还显示HepG2细胞表达HBX后，As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但HBX的表达显著抑制p53相对活性，特异性shRNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。其原因可能是HBX通过反式激活作用上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但通过蛋白-蛋白作用抑制p53的活性。

最常用的研究p53表达的方法是用Western blot定量分析总p53蛋白，再用荧光酶报告质粒共转染分析p53活性，费时且缺乏特异性，不适于多样本同时检测和比较[15]。本研究采用一种能与p53活化形式特异性结合的寡核苷酸包被96孔板，即“第一抗体”能识别有活性的与靶DNA连接的p53，再用抗p53 IgG偶联物结合和进行显色反应，检测细胞抽提物中p53的活性，同时应用的抗p53 IgG为第一抗体，通过第二抗体偶联物结合和进行显色反应检测细胞抽提物中p53的总量，灵敏性较高。

参  考  文  献

1Murakami S. Hepatitis B virus X protein: a multifunctional viral regulator. J Gastroenterol, 2001, 36: 651-660.

2Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev,2000, 64: 51-68.

3Lin Y, Nomura T, Yamashita T, et al. The transactivation and p53-interaction functions of hepatitis B virus protein are mutually interfering but distinct. Cancer Res,1997, 57: 5137-5142.

4Lee SG, Rho HM. Transcriptional repression of the human p53 gene by hepatitis B viral X protein. Oncogene, 2000, 19: 468-471.

5Wang XW, Gibson MK, Vermeulen W, et al. Abrogation of p53-induced apoptosis by the hepatitis B virus X gene. Cancer Res, 1995, 55: 6012-6016.

6Lin J, Zhu MH, Zhu S, et al. The role of hepatitis B virus X gene and p53 on hepatocellular carcinoma cell growth. Zhonghua Binglixue Zazhi, 2003, 32: 43-47.

林静,朱明华,祝峙,等.乙型肝炎病毒X和p53对肝癌细胞生长的影响.中华病理学杂志,2003,32:43-47.

7Liu LX, Zhu AL,Chen W, et al. The effect and mechanism of arsenic trioxide on hepatocellular carcinoma. Zhonghua Waike Zazhi, 2005, 43: 33-36.

刘连新,朱安龙,陈炜,等.三氧化二砷对原发性肝癌的作用及其机理研究.中华外科杂志,2005,43:33-36.

8Shen L, Chen TX, Wang YP, et al. As2O3 induces apoptosis of the human B lymphoma cell line MBC-1. J Biol Regul Homeost Agents, 2000, 14: 116-119.

9Zhao S, Tsuchida T, Kawakami K, et al. Effect of As2O3 on cell cycle progression and cyclins D1 and B1 expression in two glioblastoma cell lines differing in p53 status. Int J Oncol, 2002, 21: 49-55.

10Lu M, Xia L, Luo D, et al. Dual effects of glutathione-S-transferase pi on As2O3 action in prostate cancer cells: enhancement of growth inhibition and inhibition of apoptosis. Oncogene, 2004, 23: 3945-3952.

11Chow SK, Chan JY, Fung KP. Inhibition of cell proliferation and the action mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) on human breast cancer cells. J Cell Biochem, 2004, 93: 173-187.

12Hannon GJ. RNA interference. Nature, 2002, 418: 244-251.

13Tuschl T. Expanding small RNA interference. Nat Biotechnol, 2002, 20: 446-448.

14Paul CP, Good PD, Winer I, et al. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol, 2002, 20: 505-508.

15Gong GZ, Jiang YF, Zhu YH, et al. Regulation mechanism of HCV NS5A on p53 protein transactivity. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 162-165.

龚国忠,蒋永芳,朱映华,等.丙型肝炎病毒NS5A对p53活性调控机制研究.中华肝脏病杂志,2003,11:162-165.