【关键词】 肝纤维化； 金属蛋白酶1组织抑制剂； 基质金属蛋白酶； 罗格列酮 Effect of rosiglitazone on metalloproteinase tissue inhibitor 【Key words】 Liver fibrosis; Tissue-inhibitor of metalloproteinase-1; Matrix metalloproteinase; Rosiglitazone 【First author抯 address】 Department of Gastroenterology, Guangci Hospital, Wuhan University, Wuhan 430050, China Email: iris767181@sohu.com 罗格列酮通过激活过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARγ）而发挥作用,金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是组织中基质金属蛋白酶（MMPs）的主要内源性抑制因子[1]，其表达增加有助于网状纤维和胶原纤维沉积。我们观察罗格列酮保护大鼠肝纤维化的作用，研究大鼠肝内TIMP-1的变化，旨在探讨罗格列酮预防肝纤维化的机制。 一、材料与方法 1. 材料：（1）动物：60只健康雄性SPF级大鼠（武汉大学实验动物中心），体重120～ 2. 方法：（1）动物处理：大鼠随机分成6组，每组10只。A组：罗格列酮正常对照组，液体石蜡0.15ml腹腔注射，2次/周；每千克体重灌胃罗格列酮5mg，1次/d；B组：正常对照组，液体石蜡0.15ml腹腔注射，2次/周；与罗格列酮等体积等渗盐水灌胃，1次/d；C组：肝纤维化模型组，四氯化碳（CCl4）+液体石蜡（1∶1）混合物0.15ml腹腔注射，2次/周；与罗格列酮等体积等渗盐水灌胃，1次/d；D组（按使用剂量不同分为D1、D2、D3组）：罗格列酮肝纤维化干预组，CCl4+液体石蜡（1∶1）混合物0.15ml腹腔注射，2次/周；D1～D3组分别为每千克体重灌胃罗格列酮2、5、8mg，1次/d。实验8周后处死所有大鼠，取肝脏及心脏血标本。（2）指标检测：肝功能检测采用全自动生物化学分析仪。肝组织病理学检查：①肝组织HE染色，按文献[2]方法分为5级。Ⅰ级：纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向小叶发展的倾向；Ⅱ级：纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3及有Ⅰ级同样的改变；Ⅲ级：纤维结缔组织进入肝小叶达中央静脉周围；Ⅳ级：纤维结缔组织在全小叶分布，弥漫性假小叶形成，并有Ⅲ级同样的改变。②肝组织胶原纤维染色（Masson法）和网状纤维染色，结果经图像分析仪分析。③逆转录聚合酶链反应法测定PPARγ和TIMP-1 mRNA表达参照文献[3，4]。称取50～100mg肝组织，以Trizol提取总RNA，合成cDNA后以下列引物进行扩增：PPARγ上游引物：5′-AGGAAGAGGCTGCTG AAGTT-3′，下游引物5′-ATGACTAAGTTTGAGTTTGCT-3′；TIMP-1上游引物：5′-ATTTATCTACACGGATCC-3′,下游引物5′-CATGAACCATCACTTCTCTTG-3′;β-肌动蛋白上游引物5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′,下游引物5′-CATGGTGGTGCCCGCCAGACAG-3′。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后摄片。 3．统计学处理：计量资料以x-±s表示，多组间均数比较采用方差分析，均数间两两比较采用Fisher LSD检验，应用SPSS10.0统计软件包处理分析；纤维化程度计算有序列联表调整Ridit得分，并采用Ridit检验进行分析。均以双侧α<0.05为显著性检验标准。 二、结果 1. 罗格列酮对大鼠一般情况的影响：注射CCl4后,大鼠烦躁不安，相互攻击，造模2周后，C组大鼠开始出现毛发蓬松、污秽，大便稀，精神萎靡，活动减少，造模8周时，大鼠出现行走时左右摇摆，甚至不能站立，造模结束死亡3只；D组造模8周时大鼠大便仍成形，毛发整齐，行走正常，造模结束死亡3只。 2. 罗格列酮对大鼠肝功能的影响：C组转氨酶显著升高，白蛋白显著降低；D组转氨酶明显低于模型组，白蛋白则显著高于C组（表1）。 表1 各组大鼠血清肝功能指标的变化 组别 动物数(只) AST(U/L) ALT(U/L) 白蛋白(g/L) A 10 69.00* 34.75* 32.75* B 10 70.25* 34.50* 32.83* C 7 242.50 78.00 27.83 D1 8 115.67* 41.67* 28.03* D2 9 107.67* 40.00* 30.17* D3 10 88.33* 38.87* 31.23* 注：AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶；A组：罗格列酮对照组；B组：正常对照组；C组：肝纤维化模型组；D1组：罗格列酮肝纤维化干预1组；D2组：罗格列酮肝纤维化干预2组；D3组：罗格列酮肝纤维化干预3组；* 与C组比较，P值均<0.05 3. 罗格列酮对大鼠肝组织病理学的影响：C组大鼠腹腔注射CCl4 8周后，肝脏标本表面布满大小不一的颗粒，质地脆，HE染色切片光镜下可见肝细胞溶合、细胞核消失、细胞膜破裂后溶解坏死，导致广泛脂肪变性及空泡变性，以汇管区及中央静脉周围为重，肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，有双核细胞及肝纤维结节形成。Masson染色可见胶原纤维大量增生，沉积于汇管区及中央静脉区，使纤维间隔变宽并延长，围绕肝再生结节，部分可见大小不等的假小叶形成。D组肉眼观察肝脏表面比较光滑，质地中等，HE染色切片光镜下肝细胞亦有不同程度变性、坏死及纤维结缔组织星芒状增生，但纤维间隔较细。脂肪变性及空泡变性明显减轻，未见假小叶形成。Masson染色胶原纤维仅在汇管区周围可见少量结缔组织，未向肝实质延伸，增生程度较模型组有显著减轻，组织学改善以D3组最明显，并存在剂量依赖性（表2，3）。 表2 各组大鼠肝组织病理学变化（只） 组别 肝纤维化程度 0级 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 合计 A 10 0 0 0 0 10* B 10 0 0 0 0 10* C 0 0 1 2 4 7 D1 0 3 2 1 2 8* D2 2 2 3 1 1 9* D3 3 5 2 0 0 10* 合计 25 10 8 4 7 54 调整Ridit得分 0.236 0.555 0.718 0.827 0.927 － 注：A组：罗格列酮对照组；B组：正常对照组；C组：肝纤维化模型组；D1组：罗格列酮肝纤维化干预1组；D2组：罗格列酮肝纤维化干预2组；D3组：罗格列酮肝纤维化干预3组；* 与C组比较，P值均<0.05 表3 各组大鼠肝组织胶原纤维及网状纤维变化（x-±s） 组别 动物数(只) 胶原纤维(%) 网状纤维(%) A 10 0.1±0.1* 1.0±0.3* B 10 0.1±0.1* 1.0±0.3* C 7 12.1±1.1# 13.5±0.8# D1 8 6.1±0.2*# 4.9±0.2*# D2 9 4.8±0.5*# 2.1±0.7*# D3 10 2.2±0.2*# 1.9±0.7* 注：A组：罗格列酮对照组；B组：正常对照组；C组：肝纤维化模型组；D1组：罗格列酮肝纤维化干预1组；D2组：罗格列酮肝纤维化干预2组；D3组：罗格列酮肝纤维化干预3组；* 与C组比较，P值均<0.01；# 与B组比较，P值均<0.05 4. 罗格列酮对PPARγ和TIMP-1 mRNA表达的影响：模型组TIMP-1 mRNA表达明显增加，D组相比C组TIMP-1表达随剂量增加有逐渐减少趋势，D2、D3组明显低于模型组。与C组相比，D组PPARγ表达明显增加（表4）。 三、讨论 本实验结果显示，CCl4作用后，大鼠肝组织中TIMP-1明显升高，提示肝星状细胞被大量激活，胶原纤维和网状纤维染色可见纤维增生沉积于汇管区及中央静脉区，在肝纤维间隔内也呈弥漫分布，并有大小不等的假小叶形成。与C组相比，D组血清转氨酶水平明显下降，同时白蛋白水平明显升高，说明罗格列酮具有促进肝功能恢复的作用。逆转录聚合酶链反应检测示D组TIMP-1 mRNA表达水平明显低于模型组，同时D组PPARγ表达明显增加，提示罗格列酮可能通过激活PPARγ抑制TIMP-1上调导致的肝纤维化病变，并且罗格列酮的干预效应有明显的量效关系。 本实验结果提示，罗格列酮可下调TIMP-1基因表达，一定程度上解除了对MMP-1和MMP-9的抑制作用，有助于细胞外基质的降解，罗格列酮可能通过激活PPARγ途径，降低TIMP-1表达，继而抑制肝星状细胞的增殖及细胞外基质分泌，减轻肝脏损伤。从而证实PPARγ很可能是抗肝纤维化的一个治疗靶位，为延缓肝纤维化的进展提供了一个新思路。 参 考 文 献 1Luo YJ, Yu JP, Luo HS, et al. Prevention function study on ginkgo bibloba extract in CCl4-induced liver fibrosis. Zhonghua Xiaohua Zhazhi, 2004, 24: 307-308. 罗燕军,于皆平,罗和生，等.银杏叶提取物对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的预防作用.中华消化杂志,2004,24:307-308. 2Li S, Wu P, Yarlagadda P, et al. PPAR alpha ligand protects during cisplatin-induced acute renal failure by preventing inhibition of renal FAO and PDC activity. Am J Physiol Renal Physiol, 2004, 286: F572-F580. 3Lin Q, Ma J, Gu Y, et al. Mechanism of rosiglitazone znti-fibrosis effeat on unilateral ureteral obstruction rats. Zhongguo Linchuang Yaoxue Zazhi, 2003, 12: 135-138. 林沁，马骥，顾勇,等.罗格列酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用及其机制.中国临床药学杂志，2003,12:135-138. 4Liu ZS, Cheng GY, Song J, et al. Protective effeat of rosiglitazone on rat kidney after unilateral ureteral obstruction. Zhonghua Shenzangbing Zazhi, 2004, 20: 268-272. 刘章锁，程根阳，宋洁,等.罗格列酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的保护作用.中华肾脏病杂志,2004,20:268-272.
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