【关键词】 癌,肝细胞； NF-κB； 细胞凋亡； G(D3)神经节苷脂；阿霉素 Ganglioside GD3 enhances the anti-tumor effect of doxorubicin on hepatoma cells WANG Jian-hong, HUANG Zhi-ming, WU Jian-sheng, CHEN Xiang-rong, JIN Shu-qing, HUANG Qing-ke, WANG Dan. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; NF-kappa B; Apoptosis; G(D3) ganglioside; Doxorubicin 【First author抯 address】 Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China Email: wang730221@vip.sina.com 阿霉素能诱导肝癌细胞发生凋亡，亦能激活肝癌细胞的核因子kappa B（NF-κB）活性，从而抑制肝癌细胞的凋亡，故而影响了其抗癌疗效[1]。为此，在我们过去的研究中通过转染变异IκBα到肝癌细胞内抑制阿霉素对NF-κB的激活，进而抑制肝癌细胞的生长[2]。神经节苷脂GD3是一类含有唾液酸的糖神经鞘酯，可以抑制NF-κB从细胞质内向细胞核内移位，抑制了NF-κB的活性，达到诱导细胞凋亡的目的，而且它是一类脂溶性药物，容易透过细胞膜而发生作用[3]。本实验旨在研究神经节苷脂GD3能否抑制肝癌细胞中被阿霉素激活的NF-κB活性、促进肝癌细胞的凋亡和抑制细胞的生长，从而增加阿霉素的抗肝癌敏感性。 一、材料与方法 1. 材料：人肝癌细胞株SMMC-7721购于上海中国科学院细胞研究所；RPMI 1640购于美国Gibco公司，胎牛血清购于美国Hyclone公司；神经节苷脂GD3购于美国Matreya公司；盐酸阿霉素购于美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐购于上海华舜生物工程公司。NF-κB一致序列探针购自美国Promega公司，序列如下：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5′。 2. 方法：（1）细胞质和细胞核蛋白抽提物的制备、电泳迁移率分析参照文献[2]。（2）Western blot检测：40μg细胞质蛋白通过10%十二烷基硫酸钠胶分离后电转移至硝酸纤维素膜，10%脱脂奶粉和0.05% Tween-20室温下封闭1h，加入小鼠抗人细胞色素C（1∶1000）和caspase-3（1∶500，美国Pharmingen公司产品）室温下孵育2h，加入HRP标记的大鼠抗小鼠第二抗体孵育30min，ECL显色，X线胶片感光显影。（3）检测caspase-3的活性：300μg细胞质蛋白提取物与Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物），37℃反应3h。然后使用荧光分光光度计分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为460nm），计算caspase-3活性比值（不同处理方案/未处理肝癌细胞Ac-DEVD-AMC荧光强度）。（4）细胞凋亡酶联免疫吸附法检测：1×105 GD3预处理的SMMC-7721细胞放在24孔培养板，加入阿霉素培养24h，吸取20μl上清液，使用细胞凋亡检测酶联免疫吸附法试剂盒（德国Roche公司产品）参照产品说明书测量DNA碎片的释放情况，计算加强系数（不同处理方案DNA碎片的A值/未处理肝癌细胞DNA碎片的A值），代表细胞的凋亡水平。（5）四甲基偶氮唑盐比色实验参照文献[2]。 3. 统计学处理：用SPSS13.0统计软件进行配对t检验，数据用x-±s表示。 二、结果 1. 神经节苷脂GD3对肝癌细胞NF-κB活性的影响：2×106肝癌细胞中单纯加入1μmol/L神经节苷脂GD3培养4h，收集细胞提取细胞核蛋白，通过电泳迁移率分析发现GD3可以轻度抑制NF-κB的活性。而2×106肝癌细胞中加入5μmol/L阿霉素培养2h后，发现阿霉素能够明显地激活肝癌细胞的NF-κB活性。加入1μmol/L GD3培养4h后，再加入5μmol/L阿霉素培养的细胞，通过电泳迁移率分析发现，NF-κB的条带强度明显减弱，NF-κB的活性与单纯使用GD3相近（图1）。 2. 细胞色素C的表达情况：通过Western blot检测培养24h后细胞质蛋白中细胞色素C的表达发现，单纯使用1μmol/L神经节苷脂GD3和5μmol/L阿霉素均使细胞色素C表达增强，而先使用GD3预处理的肝癌细胞再加入阿霉素培养24h，导致细胞色素C的表达显著增强（图2）。 3. Caspase-3的表达情况和活性：通过Western blot检测培养24h后细胞质蛋白caspase-3的表达发现，单纯使用1μmol/L神经节苷脂GD3使胞色素C表达轻度增强，5μmol/L阿霉素可以使细胞色素C表达增强，而GD3预处理的肝癌细胞再加入阿霉素培养导致caspase-3的表达显著增强（图3）。通过检测caspase-3四肽荧光底物了解caspase-3的活性，同样发现GD3预处理的肝癌细胞再加入阿霉素培养24h后，caspase-3的活性显著增加。阿霉素处理组、GD3处理组、GD3＋阿霉素处理组的caspase-3活性比值分别为2.36±0.29、1.30±0.19、4.09±0.52，GD3＋阿霉素处理组与其他各组比较差异有统计学意义，t值分别为6.50、11.04，P值均<0.01。 4. 神经节苷脂GD3对于肝癌细胞凋亡的影响：通过酶联免疫吸附法检测凋亡细胞的DNA碎片发现，单纯使用1μmol/L GD3培养24h后，肝癌细胞的DNA碎片略微增加（加强系数为1.97±0.38）。虽然加入5μmol/L阿霉素培养24h可以增加肝癌细胞的凋亡，细胞的DNA碎片增多（加强系数为4.58±0.76）；但是GD3预处理的肝癌细胞再加入5μmol/L阿霉素培养后，细胞的DNA碎片显著增多，细胞凋亡的程度更为明显（加强系数为12.26±1.90）。GD3＋阿霉素处理组与其它各组比较差异有统计学意义，t值分别为11.03、14.10，P值均<0.01。 5. 神经节苷脂GD3对于肝癌细胞生长的影响：单纯使用1μmol/L神经节苷脂GD3或者5μmol/L阿霉素培养72h对于肝癌细胞的生长抑制作用不明显。然而，使用1μmol/L神经节苷脂GD3预处理，再加入5μmol/L阿霉素培养后发现，肝癌细胞的生长活性显著被抑制（表1）。 表1 四甲基偶氮唑盐法检测肝癌细胞的生长情况（x-±s） 组别 不同时间肝癌细胞生存率（％） 0h 24h 48h 72h GD3组 100 91.8±4.42 89.4±4.24 84.2±5.99 阿霉素组 100 87.9±4.15 79.7±3.78 71.3±5.59 GD3＋阿霉素组 100 77.5±6.28* 55.2±7.87* 34.4±7.88* 注：* GD3＋阿霉素处理组与其他各组比较，24h时t值分别为7.08、4.12，48h时t值分别为18.99、8.72，72h时t值分别为20.87、10.29，P值均<0.01 三、讨论 不同于变异IκBα的作用机制，神经节苷脂GD3不参与NF-κB早期磷酸化的激活过程，其主要作用是抑制NF-κB核定位信号转入核内[3]。我们发现使用阿霉素后能够激活肝癌细胞的NF-κB活性，而通过GD3对肝癌细胞进行预处理，能够有效地抑制肝癌细胞中被阿霉素激活的NF-κB活性。因此，神经节苷脂GD3代替变异IκBα抑制NF-κB活性，可以克服转染IκB质粒应用到体内时存在的缺点。 本实验结果显示，GD3预处理的肝癌细胞给予阿霉素处理后，其细胞色素C、caspase-3的释放和活性较单纯使用阿霉素处理的显著增加；而且GD3预处理的肝癌细胞加入阿霉素培养能够显著增加细胞的凋亡。这是由于阿霉素能够激活肝癌细胞的NF-κB活性，而NF-κB的激活可以抑制细胞色素C以及下游caspase-3的释放，抑制肝癌细胞的凋亡，因而拮抗了阿霉素的诱导凋亡作用[1,4]。然而GD3抑制了NF-κB的活性，不影响阿霉素诱导的细胞色素C和caspase-3的释放，故可以增加阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的作用。 在肝癌细胞生长的实验中显示，单纯使用1μmol/L GD3培养72h对于肝癌细胞的生长抑制没有明显作用，这是由于本实验使用了低浓度神经节苷脂GD3，而研究发现大于10μmol/L的GD3剂量才能有效地抑制细胞生长[3]。5μmol/L浓度的阿霉素对于肝癌细胞的生长抑制作用不足，这与我们过去的实验结果类似，即阿霉素浓度要大于20μmol/L才能取得较佳的抑制效果[2]。然而我们发现尽管使用了低剂量的阿霉素，还是能够显著地抑制低浓度GD3预处理肝癌细胞的生长活性。可见，神经节苷脂GD3增加了阿霉素的抗肝癌敏感性。 参 考 文 献 1Menetski JP. The structure of the nuclear factor-kappaB protein-DNA complex varies with DNA-binding site sequence. J Biol Chem, 2000, 275: 7619-7625. 2Wang JH, Huang QK, Chen MX. Stable inhibition of nuclear factor κB in SMMC7721 cells in creases sensitivity to Doxorubicin. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 375-376. 王剑虹，黄庆科，陈民新.抑制肝癌细胞的核转录因子活性增加阿霉素的抗癌作用.中华肝脏病杂志,2004,12:375-376. 3Colell A, Garcia-Ruiz C, Roman J, et al. Ganglioside GD3 enhances apoptosis by suppressing the nuclear factor-kappa B-dependent survival pathway. FASEB J, 2001, 15: 1068-1070. 4Wang CY, Guttridge DC, Mayo MW, et al. NF-kappaB induces expression of the Bcl-2 homologue A1/Bfl-1 to preferentially suppress chemotherapy-induced apoptosis. Mol Cell Biol, 1999, 19: 5923-5929. 《中华肝脏病杂志》版权 |