柴胡皂甙d对肝癌SMMC7721细胞环氧合酶2表达的影响

 

 

【关键词】  癌，肝细胞； 细胞凋亡； 环氧合酶-2； 柴胡皂甙

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;   Apoptosis;   Cyclooxygenase-2;   Saikosaponins

【First author抯 address】   Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Medical School of Xi抋n Jiaotong University, Xi抋n 710061, China

 

环氧合酶2（COX-2）在消化系统肿瘤的发生、发展中起着重要作用，阻断或抑制COX-2的激活及其活性，可抑制包括肝癌细胞在内的许多肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡[1]。近年研究表明，柴胡皂甙d（SSd）可调节免疫系统功能和细胞增殖，抑制肿瘤的发生、发展，但其作用机制尚不十分清楚。观察SSd对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡及COX-2 mRNA和蛋白质表达的影响，探讨其抗癌作用的可能机制，为开发应用柴胡皂甙防治肝癌等消化系统肿瘤提供理论依据。

一、材料与方法

1．实验材料：（1）主要试剂：SSd购自江西本草天工科技有限公司；胰蛋白酶、Trizol、尼美舒利(nimesulide, NS)及二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司；Hoechst 33342购自鼎国生物工程公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；聚合酶链反应（PCR）引物由上海英骏生物科技有限公司合成。（2）肝癌细胞株SMMC-7721由本院临床分子生物中心陈葳主任惠赠。

2．细胞培养与实验分组：肝癌细胞SMMC-7721用含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。将细胞随机分为5组：正常对照组；DMSO对照组；脂多糖（LPS）诱导组（LPS 100mg/L）；SSd作用组（LPS 100mg/L + SSd 10mg/L）；NS对照组（LPS 100mg/L + NS 300μmol/L）。

3. 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖情况：用培养液将细胞制备成2×108/L细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μl，24h后随机分为6组：1～5组分别加入终浓度为0、2.5、5.0、10、15mg/L SSd的培养液，第6组加入300μmol/L NS作为对照组，每组设6个复孔；分别作用24、48、72h后每孔加新配置的0.5% MTT贮存液20μl，继续培养4h，弃上清液后每孔加150μl DMSO溶解细胞内结晶，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度(A)值。抑制率（%）=(对照孔A490-实验孔A490)/对照孔A490×100%。

4. 细胞凋亡的形态学观察：制备细胞爬片，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，用5mg/L Hoechst 33342染液室温下对爬片细胞染色15min，荧光显微镜下观察并计算凋亡率。

5. DNA片段化分析：收集SSd作用48h的细胞，按照DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，上样25μl，20g/L琼脂糖凝胶电泳（55V电压电泳3～4h），用凝胶成像分析系统进行拍照分析。

6. 免疫细胞化学法检测COX-2蛋白质表达：取处理、贴壁后的细胞爬片，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定10min，自然晾干，-20℃冰箱保存。按试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色，显微镜观察。结果判断: COX-2定位于细胞质和细胞膜，阳性细胞染色呈棕褐色或棕黄色，计算阳性细胞百分比。

7．RT-PCR法检测COX-2 mRNA表达：收集SSd作用48h后的各组细胞，提取总 RNA，按照逆转录试剂盒说明制备模板cDNA。COX-2引物：上游5′-TTCAAATGAGATTGT GGGAAAATTGCT-3′，下游 5′-AGATCATCTCTGCC TGAGTATCTT-3′, 产物长度305bp；内参照β-肌动蛋白：上游5′-GTTTGCGACCTTCAACACCCC-3′，下游5′-GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC-3′，产物长度274bp。PCR条件：94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环。每个浓度设3个平行孔，重复3次。COX-2 mRNA指数=COX-2 mRNA RT-PCR产物扫描值/β-肌动蛋白mRNA RT-PCR产物扫描值。

8．放射免疫法检测COX-2活性：以细胞培养液中前列腺素E2（PGE2）的量代表COX-2活性水平。细胞分组处理48h后，洗去药物，加入30μmol/L花生四烯酸，孵育15min，收集上清液，-70℃保存备用。按PGE2放射免疫试剂盒说明方法测定PGE2水平。

9．统计学分析：实验数据用SPSS11.0软件进行t检验。

二、结果

1. MTT实验：经SSd作用后，SMMC-7721细胞生长受到不同程度的抑制，这一抑制作用随SSd作用终浓度和时间的变化而变化，以10mg/L、48h的抑制率最高，可达78%。

2. Hoechst 33342荧光染色细胞凋亡的观察：荧光显微镜下，SSd作用组和NS对照组可见核浓染呈亮蓝色、核染色质凝集及边缘化的细胞，并可见凋亡小体，而其余各组细胞胞质及胞核呈均一浓染的蓝色。每视野计数300个细胞，各组重复3次，计算出平均凋亡率。正常对照组为2.25%±0.09%，SSd作用组为16.60%±2.38%，NS对照组为20.05%±2.12%，后两组与正常对照组比较，差异均有统计学意义，t值分别为3.23、3.42，P值均<0.05。

3．DNA片段化分析：提取细胞基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳，SSd作用组和NS对照组均可见比较明显的梯状DNA条带形成，而正常对照组则为一条完整的条带（图1）。

4．肝癌细胞COX-2蛋白质及其mRNA表达：SMMC-7721细胞COX-2主要在整个细胞质，或沿核膜周边呈线状表达。经LPS诱导后，SMMC-7721细胞COX-2表达明显增加。SSd作用组和NS对照组COX-2表达则明显减少，见图2与表1。RT-PCR检测结果：SMMC-7721细胞COX-2 mRNA指数变化与COX-2蛋白质表达相似，SSd作用组和NS对照组明显降低，与LPS诱导组比较差异均有统计学意义，见图3与表1。

5．细胞培养液中PGE2含量的测定：SSd作用组和NS对照组肝癌细胞培养液中PGE2含量分别为（46.26±5.65）ng/L，（40.03±4.86）ng/L，明显低于LPS诱导组（82.35±7.88）ng/L，t值分别为2.09、2.26，P值均<0.01，接近正常对照组水平（38.15±6.64 ）ng/L。

三、讨论

COX-2属于诱导型环氧合酶，主要在炎症过程中发挥作用。近十年来研究表明，COX-2在许多肿瘤组织中表达上调，由COX-2催化合成的PGE2是诱发肿瘤细胞增殖的主要因子之一。而COX-2抑制剂，如非甾体类抗炎药等，可明显抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，目前已成为抗肿瘤药物研究的热点[2]。

柴胡皂甙是从传统中药柴胡中分离、提取出来的药理活性成分，可分为a、b、c、d等9种，以SSd的药理活性最强。近年研究表明，柴胡皂甙具有解热、镇痛和抗炎等与非甾体类药物相似的药理作用，其机制可能与抑制COX-2的活性、影响花生四烯酸的代谢有关。1994年Motoo等首先报道SSd可抑制人肝癌细胞株DNA合成和细胞生长，其后人们对SSd的抗癌作用开始进行研究，已经证实SSd可能通过SSd的直接细胞毒作用、影响肿瘤细胞黏附及诱导细胞凋亡等途径，抑制或杀死人肺癌、胃癌、肝癌、白血病细胞和小鼠移植性S-180实体瘤等肿瘤细胞[3，4]。本实验结果与上述报道结果相似，进一步证实SSd对人肝癌细胞SMMC-7721具有增殖抑制及凋亡诱导作用。

研究表明，COX-2及其产物PGE2可以通过调节多种信号传导途径而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，并能刺激肿瘤血管生成，促进肿瘤侵袭、转移，而COX-2抑制剂可以消除COX-2及其产物PGE2的上述作用，或通过COX-2非依赖途径，抑制癌细胞生长并促进其凋亡[1，2，5]。Hsu等[4]研究证实，SSd通过调节细胞凋亡相关基因p53、Fas/Fas配体和核因子-κB诱导人肝癌细胞凋亡。但SSd的抗癌作用是否同样与抑制COX-2的活性有关，尚鲜见报道。本实验结果显示，SSd在抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖及诱导凋亡的同时，能明显下调肿瘤细胞的COX-2 mRNA和蛋白质表达水平，降低COX-2活性，与COX-2选择性抑制剂NS的作用相似，提示SSd也可能通过抑制COX-2 mRNA表达而发挥抗肿瘤作用。但SSd作用组COX-2 mRNA和蛋白质表达水平及其PGE2的释放水平均较NS作用组高，考虑SSd可能是间接或非选择性作用于COX-2，下调其表达水平，影响PGE2释放，发挥肿瘤抑制和凋亡诱导作用。本实验中SSd的作用机制是否存在COX-2非依赖性途径，或与肿瘤细胞内其他信号传导通路相关联，值得进一步探讨。

参  考  文  献

1Cianchi F, Cortesini C, Fantappie O,  et al. Cyclooxygenase-2 activation mediates the proangiogenic effect of nitric oxide in colorectal cancer. Clin Cancer Res, 2004, 10: 2694-2704.

2Hashitani S, Urade M, Nishimura N, et al. Apoptosis induction and enhancement of cytotoxicity of anticancer drugs by celecoxib, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, in human head and neck carcinoma cell lines. Int J Oncol, 2003, 23: 665-672.

3Hsu YL, Kuo PL, Lin CC.The proliferative inhibition and apoptotic mechanism of Saikosaponin D in human non-small cell lung cancer A549 cells. Life Sci, 2004, 75: 1231-1242.

4Hsu YL, Kuo PL, Chiang LC, et al. Involvement of p53, nuclear factor kappaB and Fas/Fas ligand in induction of apoptosis and cell cycle arrest by saikosaponin d in human hepatoma cell lines. Cancer Lett, 2004, 213: 213-221.

5Shono T, Tofilon PJ, Bruner JM, et al. Cyclooxygenase-2 expression in human gliomas: prognostic significance and molecular correlations. Cancer Res, 2001, 61: 4375-4381.

 

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