【关键词】 肝纤维化； 雌激素类； 抗内皮细胞抗体 The significance of anti-endothelial cell antibody expression in rat liver fibrosis treated with estrogen DENG Jing-yu, HE Sheng, CHEN Bo. 【Key words】 Hepatic fibrosis; Estrogens; Anti-endothelial cell antibody 【First author抯 address】 Department of Abdominal Tumor Surgery, Cancer Hospital， Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China Email: dengery@126.com 在肝纤维化发展过程中，存有血管内皮细胞明显的病理改变，是促进肝细胞坏死和门静脉高压形成的重要原因之一[1]。随着肝功能Child-Pugh分级的降低，体内雌激素水平却显著性的升高，而过高水平的雌激素却具有损害内皮细胞的效应[2]。抗内皮细胞抗体(AECA)是一种与雌激素水平相关的自身抗体，能特异性的损伤血管内皮细胞。我们检测不同剂量的17β-雌二醇（E2）及他莫昔芬处理由四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化血清中的AECA滴度变化情况，初步了解E2水平变化和肝纤维化中血管内皮细胞病变的相关性。 一、材料与方法 1. 主要试剂：17β-E2由上海第九制药厂生产,他莫昔芬由苏州第一制药厂生产,AECA间接免疫荧光试剂盒及免疫荧光反应加样板均购自德国EUROIMMUN公司，异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠IgG由武汉博士德生物技术有限公司生产。 2. 动物模型：随机选取40只Wistar健康雄性大鼠，体重（175±15）g，2.5月龄。随机分为A、B、C、D 4组，每组10只。40只大鼠均采用CCl4诱导建造肝纤维化模型：首先以 3. 大鼠血清E2的测定：所有大鼠于第9周在腹腔注射3%戊巴比妥钠40mg/kg，全身麻醉下开腹抽取门静脉血液每只2ml，静置2h后以3000r/min高速离心2min，吸取上层血清，按雌二醇放射免疫分析药盒说明书进行E2水平测定。 4. 大鼠血清AECA滴度测定：采用间接免疫荧光技术检测，将大鼠新鲜血清用磷酸盐缓冲液、吐温缓冲液分别自1∶10至1∶10000稀释后，再按照同一血清稀释度，将各组大鼠稀释血清按组间顺序分别滴加25μl至覆有脐静脉内皮细胞(HUVEC)生物薄片的载片上，室温孵育30min，磷酸盐缓冲液、吐温缓冲液冲洗浸泡5min，滴加20μl异硫氰酸荧光素标记IgG至HUVEC载片上，室温孵育30min，PBS吐温缓冲液浸泡5min，滴加甘油至盖玻片，将载片覆有HUVEC生物薄片放在盖玻片上，倒置荧光显微镜（40×物镜，激发滤片：488nm；分光滤镜：510nm；阻挡滤镜：520nm；光源：100W汞灯）下观察荧光模型。 5. 统计学分析: 部分数据采用x-±s表示,采用SPSS12.0软件进行统计分析。 二、结果 1. 各组大鼠血清E2测定值比较: 各组大鼠血清E2测定值采用单因素方差分析，各组大鼠血清E2均值大小依次为：A＞B＞D＞C，总体均数比较,差异有统计学意义（F＝14.168，P＜0.01），但C组与D组组间均值比较差异无统计学意义（P＝0.706）。D组大鼠血清E2均值＞C主要和他莫昔芬与E2竞争性拮抗与雌激素受体结合，使得D组大鼠血清中游离的E2水平升高，并使E2抑制肝纤维化作用明显减弱[3]，肝组织纤维化明显，E2代谢能力随之也减弱，因此D组血清游离E2水平较C组可有增高，见表1。 表1 各组间大鼠雌二醇测定结果 (x-±s) 组别 例数 雌二醇(pg/ml) A组 10 4357.63±1786.42*#△ B组 10 2844.59±1365.29#△ C组 10 613.28± 162.82 D组 10 865.52± 37.63 注：* 与B组相比，P<0.05; # 与C组相比，P<0.05; △ 与D组相比，P<0.05 2. 各组大鼠血清AECA滴度比较: 大鼠血清AECA采用间接免疫荧光技术检测，血清稀释比例范围1∶10～1∶10000，AECA滴度判定标准按试剂盒说明书进行。各组大鼠血清AECA滴度比较采用秩和检验分析，各组AECA滴度高低依次为: A＞B＞C＞D，各组平均秩次比较结果经秩和检验，P<0.05，差异有统计学意义，见表2。 3. 各组大鼠血清AECA荧光图像分析比较: 为了更加客观的说明各组大鼠血清AECA滴度的变化情况，我们采用倒置荧光显微镜采图并分析（血清稀释度为1:100）。血清AECA抗体与HUVEC反应结合后，在细胞质内产生颗粒样荧光，在靠近细胞核的位置颗粒更丰富。AECA阳性表达水平采用荧光表达吸光度值与表达面积值的乘积即积分吸光度值表示，采用图像分析处理仪和IMAGE PRO PLUS 5.0软件处理。各组大鼠血清AECA的积分吸光度值比较采用单因素方差分析，各组AECA的积分吸光度均值大小依次为：A＞B＞C＞D，各组AECA的积分吸光度均值总体比较,差异有统计学意义（F＝3.929，P＝0.016），组间AECA的积分吸光度均值比较差异有统计学意义（P＜0.05），（表3，图1～4）。 表3 组间血清抗内皮细胞抗体荧光表达积分吸光度值比较(x-±s) 组别 表达面积 表达吸光度 表达积分吸光度值 A组 472.70±662.98 66.17±5.55 29272.80±38973.03*#△ B组 108.40±124.99 68.54±1.26 7353.77± 8349.90#△ C组 87.60± 65.69 44.73±1.08 3951.63± 2987.68△ D组 66.80± 66.13 34.90±1.92 2301.57± 2259.70 注：* 与B组相比，P<0.05; # 与C组相比，P<0.05; △ 与D组相比，P<0.05 4. 大鼠血清E2水平与AECA滴度的相关性:对A、B、C组大鼠血清E2水平与AECA荧光表达积分吸光度值进行直线相关分析得知，E2水平与AECA滴度具有直线相关关系，r＝0.048，P＜0.05。D组由于肝内雌激素受体被他莫昔芬紧密结合，E2无法与雌激素受体结合发挥其生物学效应，故不加入E2水平与AECA的相关性分析。 三、讨论 肝纤维化和肝硬化组织中的微血管结构大都已有明显的病变，而微血管病变又是促进肝细胞局灶性萎缩和结节性增生，成为肝纤维化和肝硬化病理基础的重要原因[4-6]。血管病变往往都是从内皮细胞损伤开始的，进一步发展至血管内膜完整性和延续性被破坏、血栓形成及血管闭塞。AECA是一组特异性损伤血管内皮细胞的异质性抗体，已在多种原发性血管炎和其他血管疾病中证实，其产生机制与自身免疫紊乱也有密切的相关性[7, 8]。 E2对于肝纤维化发展的抑制作用得到广泛的认识，但为何临床上仍有大量雌激素水平明显升高的肝纤维化肝硬化患者病情没有缓解，甚至还有加重呢？本研究结果显示，给予外源性E2的CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型血清中E2水平相应升高，并与外源性E2使用的剂量呈依赖关系。D组大鼠因为给予的他莫昔芬与E2竞争性拮抗与雌激素受体结合，使得该组大鼠血清中游离的E2水平升高，但却不能发挥其生物效应。各组大鼠血清AECA滴度及荧光表达积分吸光度值分析比较结果，AECA滴度及荧光表达积分吸光度值随外源性E2使用剂量呈依赖性增高，而他莫昔芬则能降低AECA滴度及荧光表达积分吸光度值。直线相关分析发现，A、B、C组大鼠血清E2与AECA荧光表达积分吸光度值具有直线相关（r＝0.048, P＜0.05）。因此，我们认为E2能够明显的促进大鼠肝纤维化模型血清中AECA滴度的升高，导致血管内皮细胞和微血管系统破坏加重，可进一步促进肝纤维化的发展，而他莫昔芬则具有相反的作用。 参 考 文 献 1Liu JH, Yan JY, Ma Y. Relations between hepatic vascular lesions and hepatic fibrotic and cirrhotic changes in chronic hepatitis. Zhonghua Xiaohua Zazhi, 1998, 18: 274-277. 刘健虎,严家勇,马勇. 慢性肝炎肝组织内血管病变与肝纤维化及肝硬化的关系.中华消化杂志,1998,18:274-277. 2Deng JY, Shi D. Effect of estrogen on vascular endothelial cells and on the development of Buerger抯 disease. Zhongguo Putong Waike Zazhi, 2002, 11: 746-748. 邓靖宇,时德.雌激素对血管内皮细胞的影响及在Buerger’s病发生发展中的作用.中国普通外科杂志，2002,11:746-748. 3Xu JW, Gong J, Chang XM, et al. Estrogen reduces CCL4-induced liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol, 2002, 8: 883-887. 4Shi HT, Leng ER, Li T. Clinical significance of blood platelet activation and endothelial cell injury in cirrhosis. Linchuang Neike Zazhi, 2001, 18: 42-43. 史洪涛,冷恩仁,李陶.肝硬化患者血小板活化状态与内皮细胞损伤测定的临床意义.临床内科杂志,2001,18:42-43. 5McCormick A, Qasim A. Advances in portal hypertension. Med J 6Amitrano L, Guardascione MA, Brancaccio V, et al. Risk factors and clinical presentation of portal vein thrombosis in patients with liver cirrhosis. J Hepatol, 2004, 40: 736-741. 7Tamby MC, Chanseaud Y, Humbert M, et al. Anti-endothelial cell antibodies in idiopathic and systemic sclerosis associated pulmonary arterial hypertension. Thorax, 2005, 60: 765-772. 8Renaudineau Y, Grunebaum E, Krause I, et al. Anti-endothelial cell antibodies (AECA) in systemic sclerosis--increased sensitivity using different endothelial cell substrates and association with other autoantibodies. Autoimmunity, 2001, 33: 171-179.
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