【关键词】 肝纤维化； 转化生长因子β； 疫苗； 基质金属蛋白酶；金属蛋白酶类组织抑制剂 Effect of TGFβ1 vaccine on the expression of MMP-2 and TIMP 【Key words】 Liver fibrosis; Transforming growth factor beta; Vaccines; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitors of metalloproteinases 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hosptial of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China Corresponding author: CHEN Yong-ping, Email: ypchen106@yahoo.com.cn 转化生长因子β1（TGFβ1）是肝纤维化的启动、进展乃至肝硬化的形成中发挥核心作用的细胞因子，是激活肝星状细胞（HSC）并促进其表达细胞外基质（ECM）的关键因素[1]。我们曾提出构建TGFβ1抗原编码序列与乙型肝炎核心抗原（HBcAg）编码序列的融合基因, 将TGFβ1构建为疫苗,刺激机体产生抗体,中和自体产生的过量的TGFβ1,从而达到预防和治疗纤维化的目的[2]。本研究旨在探讨该融合蛋白对实验性肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2) 表达的影响，以期能进一步证实TGFβ1疫苗在肝纤维化治疗中的作用,现报道如下。 一、材料与方法 1. 实验动物: 雄性SD大鼠，体重120～ 2. 主要药品与试剂: TGFβ1疫苗由温州医学院附属第一医感染疾病中心实验室制备，二甲基亚硝胺及弗氏佐剂购自美国Sigma公司，免疫组织化学第一、二抗体试剂购自美国Santa cruz 公司，免疫组织化学DAB显色试剂盒购自福建迈新公司。 3. 动物模型的建立: 健康雄性SD大鼠40只，随机分为4组：A组: 正常组10只，B组：肝纤维化模型组10只, C组:TGFβ1疫苗干预组10只，D组：秋水仙碱治疗组10只。以0.5%的二甲基亚硝胺（DMN）腹腔内注射建立肝纤维化模型，每周前3d连续给药，共4周；TGFβ1疫苗治疗组在注射DMN的基础上于第1周第1天在背部皮下注射疫苗150μg，注射前疫苗用弗氏完全佐剂（FCA）充分混匀乳化，第3周第1天疫苗用弗氏不完全佐剂（FIA）充分混匀乳化后背部皮下注射疫苗150μg；秋水仙碱治疗组在开始注射DMN第3周加用秋水仙碱0.1ml·kg-1·d-1灌胃给药。第6周末处死各组大鼠,取出肝组织立即用中性甲醛固定12h，之后脱水透明石蜡包埋。 4. 肝脏组织病理检查: 肝组织标本石蜡切片经苏木素-伊红染色及Masson三色染色后普通光学显微镜下观察肝组织结构的变化。 5. 血清学检测: 采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（Alb），放射免疫测定血清透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）的水平。 6. 免疫组织化学染色: 采取热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0.01mol/L枸橼酸缓冲液，微波炉加热 7. 统计学处理：采用SPSS10.0统计软件分析，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，对含等级资料的进行秩和检验。 二、结果 1. 肝功能指标检测结果：与正常对照组比较，肝纤维化模型组血清ALT、AST明显升高，与模型组比较，经TGFβ1疫苗和秋水仙碱治疗后，血清ALT和AST明显下降,见表1。数据经方差齐性检验后，各组之间的方差具有齐性，ALT：F＝67.166, P<0.01；AST：F＝79.542, P<0.01；Alb：F＝0.237, P>0.05。 2. 血清HA及LN的变化：与正常组比较，模型组血清HA及LN的浓度明显升高，与模型组比较，经TGFβ1疫苗治疗后，血清HA、LN水平明显下降,见表1。数据经方差齐性检验后,各组之间的方差具有齐性，HA：F＝59.012，P<0.01；LN：F＝61.216，P<0.01。 3. 肝脏组织病理学检查结果：模型组多数大鼠正常小叶结构破坏或消失，由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割、包绕肝小叶，肝细胞索排列紊乱，肝细胞浊肿明显，坏死出血较多。纤维隔内有大量炎性细胞浸润。与模型组相比，治疗组肝细胞坏死、纤维组织增生减少，肝小叶结构破坏减轻，纤维条索疏松变窄，肝细胞水肿好转，肝内炎症细胞浸润减少。实验组大鼠肝脏病理分级使用秩和检验。 B组与C组比较u值为2.000，P<0.05，B组与D组比较u值为3.000，P<0.05，各实验组大鼠肝脏病理纤维化分级情况见表2。 表2 各实验组大鼠肝脏病理分级（只） 组别 动物数 肝纤维化分级 （只） 0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ A组 10 10 0 0 0 0 B组 10 0 0 0 2 8 C组 10 0 7 2 1 0 D组 10 0 3 4 3 0 注：A组: 正常组；B组：肝纤维化模型组；C组：转化生长因子β1疫苗干预组；D组：秋水仙碱治疗组 4. 大鼠肝组织的免疫组织化学检查结果：模型组MMP-2、TIMP-2、TGFβ1免疫组织化学表达均明显增强,与模型组比较，两治疗组TIMP-2、TGFβ1免疫组织化学表达显著减轻, 差异有统计学意义，治疗前后MMP-2表达无显著变化，见表3。模型组与TGFβ1干预组大鼠肝组织内TIMP-2、TGFβ1的表达见图1～4。数据经方差齐性检验后,各组之间的方差具有齐性（MMP-2：F＝6.223, P<0.01；TIMP-2：F＝25.331, P<0.01；TGFβ1：F＝39.405, P<0.01)。 表3 各实验组大鼠免疫组织化学检测结果（A值，x-±s） 组别 动物数（只） MMP-2 TIMP-2 TGFβ1 A组 10 8.9±0.9 8.2±1.1 8.6±1.1 B组 10 12.4±2.0 21.9±3.8 18.5±2.5 C组 10 12.1±3.8 15.8±4.4 13.0±2.2 D组 10 13.8±2.9 16.0±3.8 15.6±2.4 注：TGFβ1：转化生长因子β1；MMP-2：基质金属蛋白酶-2；TIMP-2：基质金属蛋白酶组织抑制因子-2；A组: 正常组；B组：肝纤维化模型组；C组：TGFβ1疫苗干预组；D组：秋水仙碱治疗组 三、讨论 肝纤维化的发生发展受诸多因素调控，TGFβ1是调控肝纤维化发生发展的核心物质。发生肝纤维化的机制可能与刺激HSC的活化，并大量合成分泌胶原、LN、蛋白多糖、 刺激库普弗细胞的活化和迁移，并分泌某些细胞因子、抑制胶原酶和蛋白酶的产生，并且上调基质金属蛋白酶抑制因子等因素有关[3-5]。本实验结果显示出TGFβ1与大鼠肝纤维化病理分级存在明显的相关性，因此，拮抗TGFβ1的作用已成为探索逆转肝纤维化的新途径，针对TGFβ1开发新的药物治疗肝纤维化是肝纤维化领域的研究热点之一。我们曾提出将TGFβ1构建为疫苗,刺激机体产生抗体,中和自体产生的过量的TGFβ1, 从而达到预防和治疗纤维化的目的[2]。但由于免疫系统对自身成分的免疫耐受及TGFβ1的免疫抑制作用，单纯的TGFβ1不能有效的刺激机体产生抗体，必须将TGFβ1抗原基因与HBcAg编码基因融合,制备重组蛋白，才能刺激机体产生针对TGFβ1的抗体。之前，我们已经成功构建了TGFβ1抗原编码序列与HBcAg编码序列的融合基因,并且证明其表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性[2]。本实验旨在观察TGFβ1疫苗对肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子的影响，以此来探讨TGFβ1疫苗抗肝纤维化的治疗效果和可能机制。 MMPs与TIMPs存在于多种组织器官，参与ECM代谢，在生理和病理过程中起着重要作用。肝细胞与多种间质细胞均能不同程度合成MMPs与TIMPs，并通过复杂的调节机制，在维持正常肝脏纤维组织中ECM的合成与降解的动态平衡中起关键作用。免疫组织化学研究表明MMP-2主要位于窦内皮细胞、血管内皮细胞及肝窦细胞，MMP-2免疫组化阳性表达肝纤维化组明显高于对照组，说明MMP-2与肝纤维化关系密切。本实验在蛋白质水平反映TIMP-2在肝纤维化大鼠中的表达情况，肝纤维化大鼠肝脏中肌成纤维细胞、成纤维细胞有TIMP-2蛋白的高表达，阳性信号呈现为棕黄色颗粒状，分布在肝细胞细胞质中,未见细胞核表达，提示在肝纤维化中，肌成纤维细胞和成纤维细胞是TIMP-2表达的主要细胞。有报道在正常大鼠肝组织可见TIMP-2的基因极低水平表达，随着纤维化程度的加重，TIMP-2的基因和蛋白表达水平随之增高。实验结果表明，肝纤维化时TIMP-2表达增强且与正常组比较差异有统计学意义，TIMP-2通过对MMP-2、MMP-9等金属蛋白酶活性的抑制促进ECM的沉积。 实验发现经TGFβ1疫苗干预后,与模型组相比，血清学研究结果显示：肝功能指标有明显的改善，病理组织学改变显示肝纤维化程度明显减轻。肝纤维化大鼠肝组织MMP-2表达明显增强，但治疗组MMP-2表达与肝纤维化模型组比较差异无统计学意义,表明治疗实验性肝纤维化大鼠可能不是通过调节ＭＭＰ-2表达来实现的。肝纤维化模型组大鼠肝组织TIMP-2的阳性表达较正常对照组明显增高,表明TIMP-2参与肝纤维化的发生和发展。研究还显示:经治疗后,大鼠肝组织TIMP-2的表达较肝纤维化模型组明显降低，差异有统计学意义，表明TGFβ1疫苗治疗实验性大鼠肝纤维化机制之一可能为注射TGFβ1疫苗后能够刺激机体产生抗体，中和自体产生的过量的TGFβ1，从而抑制了细胞因子的级联放大反应，抑制HSC的活化，下调TIMP-2的表达，在一定程度上解除对MMPs的抑制作用，有助于ECM的降解。TGFβ1调控MMPs和TIMPs表达的机制非常复杂，可以通过不同的下游事件来完成对MMPs和TIMPs家族成员的基因表达调控作用，这些下游事件主要包括Smad通路、促分裂原活化蛋白激酶通路以及刺激激活蛋白-1转录因子的生成等。至于TGFβ1以何种通路调节MMPs和TIMPs基因的表达因细胞类型不同而异，国外有学者报道TGFβ1具有促进TIMP-1和抑制TIMP-2的作用，但该项研究为体外试验，且为针对骨关节炎的软骨细胞的研究，明显不同于肝纤维化复杂的细胞因子网络的调控。我们的研究显示TGFβ1与TIMP-2存在显著正相关且TGFβ1疫苗能下调TIMP-2的表达，目前国内外有关肝纤维化的各种治疗手段对MMPs和TIMPs的影响，也均为通过下调TIMP-1、TIMP-2的表达来实现肝纤维化的好转[6-8]。因此，更全面地探究MMPs/TIMPs成员受TGFβ1调控的具体机制，以及更宏观地探讨各条信号通路之间的调控关系，无疑是值得进一步探索的问题。此外，乙型肝炎病毒本身对肝细胞无直接损伤作用,但其结构蛋白诱导宿主的免疫应答是否会可能导致细胞损伤，降低TGFβ1水平的抗肝纤维化治疗,对机体有何不良影响及安全性问题,均有待于我们更多的实验研究。 参 考 文 献 1Ray S, Broor SL, Vaishnav Y, et al. Transforming growth factor beta in hepatitis C virus infection: in vivo and in vitro findings. J Gastroenterol Hepatol, 2003, 18: 393-403. 2Chen YP, Pan CW, Wang XD, et al. Expression and characterization of fusion gene of transforming growth factor beta1 and hepatitis B virus core antigen. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 2005, 23: 328-330 陈永平,潘陈为,王晓东,等.转化生长因子β1与乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的表达和鉴定.中华传染病杂志,2005,23:328-330. 3Flisiak R, Maxwell P, Prokopowicz D, et al. Plasma tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and transforming growth factor beta 1--possible non-invasive biomarkers of hepatic fibrosis in patients with chronic B and C hepatitis. Hepatogastroenterology, 2002, 49: 1369-1372. 4Dooiey S, Delvoux B, Lahme B, et al. Modulation of transforming growth factor β response and signaling during transdifferentiation of rat hepatic stellate cells to myfivroblasts. Hepatology, 2000, 31: 1094-1106. 5Hall MC, Young DA, Waters JG, et al. The Comparative role of activator protein 1 and smad factors in the regulation of Timp-1 and MMP-1 gene expression by transforming growth factor-beta1. J Biol Chem, 2003, 278: 10304-10313. 6Chen MH, Chen JC, Tsai CC, et al.Sho-saiko-to prevents liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats. Am J Chin Med, 2004, 32: 195-207. 7Flisiak R, Al-Kadasi H, Jaroszewicz J, et al. Effect of lamivudine treatment on plasma levels of transforming growth factor beta1, tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and metalloproteinase 8Refik Mas M, Comert B, Oncu K, et al. The effect of taurine treatment on oxidative stress in experimental liver fibrosis. Hepatol Res, 2004, 28:207-215.
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