血浆蛋白质组模式预测鼠不同时期肝纤维化

【关键词】  肝纤维化； 蛋白质组； 模型，动物； 表面增强激光解吸电离技术

Plasma proteomic pattern predicts the stages of rat liver fibrosis    ZHANG Qi-sheng, John M Luk.

【Key words】     Liver fibrosis;   Proteome;   Models, animal;   SELDI

【First author抯 address】   Department of Gastroenterology, Branch of Shanghai No.1 People抯 Hospital, Shanghai 200081, China

Email: zhangqish@hotmail.com

蛋白质组模式在肿瘤性疾病的诊断方面应用已经较多，显示了良好的应用前景[1-3]，但关于蛋白质组模式在肝纤维化时的改变较少有文献报道。为寻找一种新的、理想的诊断肝纤维化的方法，我们制备了不同时期肝纤维化鼠模型，用蛋白芯片技术检测鼠血浆标本，根据血浆蛋白模式建立不同时期肝纤维化判别函数，并用鼠肝纤维化模型验证该判别函数的准确性。

一、材料与方法

1．肝纤维化动物模型制备、动物分组和处理：选择雄性SD大鼠（香港大学医学动物实验中心提供），体重250g左右。胆总管结扎（BDL）方法：苯巴比妥钠（60mg/kg，腹腔内注射）麻醉大鼠，打开腹腔，用双线结扎胆总管，然后在中间剪断。根据实验需要培养2～5周。将大鼠分为5组：假手术对照组，早、中、晚期肝纤维化组（大约在手术后1、2、3或4周）和胆管肠吻合术后组，每组各6只。大鼠BDL后1周，行胆管肠吻合术，解除胆管梗阻，恢复胆汁流。2周后收集鼠血浆标本，-80℃保存。处死大鼠，在肝右叶相同部位切取肝组织，甲醛固定，石蜡包埋。

2．Masson三色染色和肝纤维化分期：将肝组织石蜡切片在二甲苯和梯度乙醇(100%、95%、85%、75%、60%和50%)中脱蜡，然后用Masson三色法对胶原进行染色（AccustainTM三色染色试剂盒，美国Sigma公司）。按照Scheuer系统[4]对肝纤维化进行评分和分级：0期，无纤维化；1期，门管区扩大，纤维化；2期，门管区周围纤维化或门管区-门管区隔形成，但小叶结构完整；3期，纤维化伴小叶结构扭曲，但无肝硬化；4期，肯定的肝硬化。我们把1和2期分别认为是早期和中期纤维化，3和4期认为是晚期纤维化。

3．表面增强激光解吸电离技术（SELDI）检测分析：选用弱阳离子交换型芯片CM-10。不同时期肝纤维化鼠血浆样本各取5μl，用U9结合缓冲液｛8mol/L尿素，20g/L 3-［3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐，50mmol/L Tris-HCl，pH 9.0｝平衡后，在冰上孵育30min，摇动。50mmol/L乙酸钠洗涤芯片2次后，对已用U9缓冲液处理的标本按1∶13进行稀释。将稀释后的血浆标本（100μl）加入蛋白芯片，孵育1h，摇动。用乙酸钠洗涤3次后，用水冲洗，风干。各点加0.5μl饱和芥子酸溶液，自然风干。最后将芯片用蛋白质生物学系统 Ⅱ质谱仪（美国Ciphergen Biosystems公司）进行分析。所有标本的质谱强度用质量/电荷比（M/Z）在 2000～30000之间的离子流进行标化，质子窗误差设定为0.3%，分析软件为蛋白芯片软件3.1（美国Ciphergen Biosystems公司）。根据SELDI软件的生物标记向导功能，识别在不同组标本中有不同表达的蛋白质峰，在显示的106个蛋白质峰中，有56个被认为差异显著，用SPSS判别软件进行分析。

4．统计学分析：应用SPSS10.0软件对有意义的蛋白质峰进行分析, 选用顺时针判别模式，将正常对照组，假手术对照组，早、中、晚期肝纤维化组和胆肠吻合术后组作为组别，将有意义的蛋白质点作为独立变量，用Box’s M统计量检验各组协方差矩阵的齐同性，以最小Wilk’s lambda值的自变量作为入选者。F统计量对应的P值＜0.1倍入选自变量，>0.11删除自变量，选用Fisher’s和非标准化的典则判别函数系数，建立典则判别函数[5]。根据除去该个体本身时求得的函数对个体进行分类。

二、结果

1．肝组织学和肝纤维化分期：由BDL诱导的肝纤维化鼠肝组织石蜡切片Masson三色染色结果：门管区水肿、扩张，小胆管增生，呈葡萄状，叶间胆管和区段胆管扩张，纤维组织大量沉积，纤维隔将肝实质分割成锯齿状。1周时门管区扩张，纤维条带明显，但无桥样连接形成；2周时有明显的门管区-门管区、门管区-中央静脉纤维隔形成，但小叶结构完整； 3周和4周时，除有2周时所见，肝小叶结构明显变形。因而，我们以1周时代表早期肝纤维化，2周代表中期肝纤维化，3周和4周代表晚期肝纤维化（图1）。

2．组成蛋白质组模式的6个潜在生物标记：根据SPSS统计分析结果，从56个入选的分析变量中我们发现了6个潜在的生物标记，它可以区别早、中、晚期肝纤维化。这6个蛋白质的M/Z范围均在7041～14366之间，分别为7705、8809、9568、14366、7041、7616（表1）。

3．蛋白质组模式对早、中、晚期肝纤维化的分类结果：实际分类的源计数：第1周6只，第2周5只，第3周6只，假手术5只；而预测分类计数：第1周6只，第2周5只，第3周6只，假手术5只，各组预测正确率均为100%。交叉验证亦显示各组分类正确率均为100%。

4．血浆蛋白质谱图和胶图的改变：由血浆蛋白质质谱图和模拟胶图可见，与纤维化相关的下调的血浆蛋白质峰为8809 和8908（图2A），上调的血浆蛋白质峰为7603、7691（图2B）和 9050（图2C），由判别分析发现的其他3个生物标记蛋白质(9569、7041和14866)无明显的相对应的蛋白质质谱被发现。当胆肠吻合的大鼠恢复后，血浆蛋白质质谱恢复到假手术对照鼠水平。

三、讨论

近年研究显示，利用一组生物标记诊断和预测肝纤维化的发展是一个很有价值的方法，Imbert-Bismut等[6]选用血清总胆红素、载脂蛋白A1、α2-巨球蛋白、α2-球蛋白、γ-球蛋白和γ-谷氨酰转肽酶作为一个判别模式对肝纤维化状况进行分析，敏感性和特异性分别为75%和85%。Forns等[7]根据年龄、血小板计数、γ-谷氨酰转肽酶和血胆固醇，建立判别标准，51%的患者可以被准确分类，这些研究显示了应用一组非特异性指标作为一个判别模式在肝纤维的诊断和分期中有良好的应用前景。

利用蛋白质组模式进行诊断，为疾病的诊断提供了一个新的方法，从理论上讲，它适用于任何疾病状态。Zhu等[8]应用蛋白质芯片技术，对一组慢性肝病患者进行检测，发现了两个分子量分别为7.772×103和3.933×103的新的生物标记，可以将肝硬化和非肝硬化患者区分开，特异性81.8%，敏感性80%，阳性预测值75%。Xu等[9]应用SELDI技术，根据基于粗糙集理论的支撑向量机预测模型运算法则，从大鼠肝硬化模型血浆蛋白质组学分析结果中找到6个重要生物标记（M/Z分别为1743.12、3515.68、3537.26、4186.07、4902.63和8201.04），应用这组被选择的蛋白质标记，肝硬化和非肝硬化鼠分类的敏感性和特异性均达到92%以上。本实验比较了早、中、晚期肝纤维化大鼠血浆蛋白质组学，找到了一个由6个蛋白质或多肽组成的模式，根据它可以将早、中、晚期肝纤维化大鼠100%正确分类，交叉验证正确率也为100%。虽然这是一个初步结果，但仍令人鼓舞，因为它可能应用到临床判断慢性肝病的预后和指导治疗。

反应肝纤维化的直接标记如细胞因子和胶原代谢产物，通常半衰期较短。细胞外基质（ECM）的更新与新的ECM的沉积和消除，或原有ECM的重组有关。血浆中直接标记物水平或者反应该更新过程的活性，或者反应重组的ECM总量，用一个单一的生物标记来诊断和区分肝纤维化是不可能的。本研究找到了由6个蛋白质或多肽组成的一个判别模式，可以准确区分不同时期肝纤维化，但在血浆蛋白质质谱图上，只有7705、7616和8809这3个蛋白质峰可以清楚显示，另外3个显示不明显。同样，在蛋白质质谱图上，9068和8905蛋白质峰可认为是两个良好的生物标记，但在统计学上它们却未被判别分析模式选中。所以应用蛋白质芯片技术做血浆蛋白质组学分析，M/Z具有较高密度的蛋白质不一定就是好的生物标记，而M/Z具有较低密度的蛋白质却可能是好的生物标记。在某些疾病中，蛋白质的改变通常是边缘状态或不明显，正如本研究所示14366蛋白质峰具有较低密度，但它仍是一个好的生物标记。

参  考  文  献

1Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 2002, 359: 572-577.

2Petricoin EF 3rd, Ornstein DK, Paweletz CP, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 2002, 94: 1576-1578.

3Adam BL, Qu Y, Davis JW, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res, 2002, 62: 3609-3614.

4Scheuer PJ. Classification of chronic viral hepatitis: a need for reassessment. J Hepatol, 1991, 13: 372-374.

5Liu RX, ed. Medical statistical methods and application of SPSS 10.0. Guangzhou: Guangdong People抯 Publishing House, 2001. 120-130.

刘润幸,主编.SPSS 10.0 医学统计方法与应用.广州:广东人民出版社,2001.120-130．

6Imbert-Bismut F, Ratziu V, Pieroni L, et al. Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus infection: a prospective study. Lancet, 2001, 357: 1069-1075.

7Forns X, Ampurdanes S, Llovet JM, et al. Identification of chronic hepatitis C patients without hepatic fibrosis by a simple predictive model. Hepatology, 2002, 36: 986-992.

8Zhu XD, Zhang WH, Li CL, et al. New serum biomarkers for detection of HBV-induced liver cirrhosis using SELDI protein chip technology. World J Gastroenterol, 2004, 10: 2327-2329.

9Xu XQ, Leow CK, Lu X, et al. Molecular classification of liver cirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics. Proteomics, 2004, 4: 3235-3245.