腺病毒介导MDA7IL24选择性促进肝癌细胞的凋亡和增殖阻滞

 

【摘要】  目的  观察MDA-7/IL-24基因对不同p53状态人肝癌细胞HepG2、MHCC97L以及Hep3B和正常的肝细胞L02的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法  将携带人MDA-7/IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和不同p53状态的肝癌细胞HepG2、MHCC97L、Hep3B。通过逆转录聚合酶链反应方法观察MDA-7/IL-24基因的表达，酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白的浓度，通过四甲基偶氮唑盐染色法及Hoechst染色观察MDA-7/IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-Ⅴ和碘化丙啶双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，应用流式细胞仪检测细胞周期。 结果  复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7/IL-24在肝癌细胞株HepG2，MHCC97L和Hep3B以及正常细胞L02中高效表达。细胞培养上清液中有MDA-7/IL-24蛋白表达。MDA-7/IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长，Hoechst染色提示MDA-7/IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞无影响，细胞周期分析提示MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞在G2/M期，同时对正常的肝细胞没有促凋亡作用和增殖阻滞作用。 结论  复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7/IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性地杀伤肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡而与肿瘤细胞的P53基因的状态无关，同时对正常的肝细胞L02无任何毒性作用。

【关键词】  癌，肝细胞； 腺病毒，人； 基因疗法

 

【Abstract】    Objective    To investigate the effect of  melanoma differentiation associated gene-7/interleukin 24 ( MDA/IL-24) on human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2, MHCC97L and Hep3B and normal liver cell line L02 with a different p53 state. Methods    The MDA-7/IL-24 gene was transfected into human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2, MHCC97L and Hep3B and hepatocyte line L02 with a replication-incompetent adenovirus vector. The mRNA expression of MDA7/IL-24 in HepG2, MHCC97L, Hep3B and L02 cells was confirmed using RT-PCR. Protein expression was confirmed using ELISA assay. MTT assay and flow cytometry were used to study tumor cell proliferation and cell cycle in vitro. Hoechst and flow cytometry assay after annexin-V and PI staining were performed to indicate the apoptosis effect. Results    Exogenous MDA-7/IL-24 gene was expressed in HepG2, MHCC97L, Hep3B and L02 cells. The protein product of MDA-7/IL-24 was confirmed in the supernatant. MTT assay and apoptosis test indicated MDA-7/IL-24 could induce growth suppression and apoptosis of HepG2, MHCC97L and Hep3B but could not in L02. Cell cycle test revealed MDA-7/IL-24 could block those cancer cells in G2/M but not in the normal cell L02. Conclusion    MDA-7/IL-24 selectively induces growth suppression and apoptosis in hepatocellular carcinoma lines HepG2, MHCC97L and Hep3B in vitro independent of the state of p53 gene but not in normal liver cell L02. This indicates MDA-7/IL-24 can be a perfect gene for gene therapy in hepatocellular carcinoma.

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;   Adenoviruses, human;    Gene therapy

 

    MDA-7/IL-24（melanoma differentiation associated gene-7，MDA-7）是Fisher应用亚减法技术于1993年从黑色素瘤细胞中经人干扰素（IFN）β和MEZ（mezerin, PKC激活剂）诱生而获得的[1]，因此得名MDA-7，后来根据其生物学特性和染色体定位被命名为白细胞介素（IL）-24[2，3]。研究发现MDA-7/IL-24对肿瘤具有选择性杀伤作用[1-3]，即能选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞不产生不良反应。现构建了携带人MDA-7/IL-24基因的复制缺陷型腺病毒，并感染不同p53状态的人肝癌细胞株HepG2、MHCC97L和Hep3B以及正常肝细胞L02，观察该基因在细胞中的表达及其对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，为其临床应用提供依据。

材料与方法

1. 细胞和试剂：DMEM培养基及胎牛血清均为美国Hyclone公司产品；青霉素、链霉素及琼脂为美国Sigma公司产品。Trizol RNA提取试剂盒为美国TRI Reagent公司产品；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒为立陶宛MBI公司产品，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒为美国RapidBio公司产品，抗体为美国Biotin公司产品。细胞增殖试剂盒购自德国Roche公司；Hoechst33258 试剂为美国Sigma公司产品，Annexin-Ⅴ-PI试剂盒为晶美公司产品。人胚肾细胞株（HEK293）购于美国典型培养物收藏中心。人肝癌细胞株HepG2由许荣华博士惠赠， MHCC97L和Hep3B购于上海复旦大学肝癌研究所，正常肝细胞株L02购于武汉生物典藏中心。MDA-7/IL-24的PCR上、下游引物5′-GGGCTGTGAAAGACACTAT-3′；5′-GCATCCAGGTCAGAAGAA-3′，扩增片段为381bp，Actin引物5′-CCTTCCTGGGCAATG GAGTCCT-3′，5′-GGAACAATGATCTTGAT CTT-3′，扩增片段为201bp。引物由美国Invitrogen公司合成。

2. 重组腺病毒的构建：采用RT-PCR和同源重组的方法构建Ad.mda-7、Ad.GFP、Ad.vec三种腺病毒，在293细胞中大量扩增后-80℃备用。

3. 细胞培养：人肝癌细胞株HepG2、MHCC97L和正常肝细胞株L02细胞，用高糖DMEM培养基（含10%小牛血清），Hep3B用含丙酮酸钠和非必须氨基酸的高糖型DMEM（含10% Hyclone特级胎牛血清），培养基中含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，在有一定湿度，37℃体积分数5%的CO2培养箱中培养。取对数生长期的人肝癌细胞株HepG2、MHCC97L、Hep3B和正常肝细胞株L02细胞4种细胞，分成3组即对照组（无血清DMEM组），Ad.vec组（不含目的基因的空病毒组）和Ad.mda-7组，将纯化的腺病毒按每个细胞500病毒颗粒（viral particle，vp）感染上述细胞，Hep3B以每个细胞250vp的病毒量感染，MHCC97L以每个细胞1000vp的病毒量感染。

4. RT-PCR检测外源性MDA-7/IL-24 mRNA在肝癌细胞和正常细胞中的表达：试验感染48h后，按Trizol 试剂盒说明提取各细胞总RNA,并以其为模板进行半定量RT-PCR循环。上游引物为5′-GGG CTGTGAAAGACACTAT-3′；下游引物为5′-GCA TCCAGGTCAGAAGAA-3′，扩增片段长度为381bp。反应条件: 96℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环；72℃延长5min。同反应条件扩增Actin片段，上游引物为5′-CCTT CCTGGGCAATGGAGTCCT-3′，下游引物5′-GG AACAATGATCTTGATCTT-3′，长度为201bp。引物由Invitrogen公司合成。RT-PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

5. 酶联免疫吸附技术（ELISA）：采用ELISA方法检测培养细胞上清液中MDA-7/IL-24蛋白表达。取对数生长期的人肝癌细胞株HepG2、MHCC97L、Hep3B和正常肝细胞株L02细胞4种细胞，用胰酶消化后，分别以105细胞种于24孔板中，当细胞生长到40％左右后，每种细胞分成3组，每组3孔，每孔按病毒转染方法同前，对照组用无血清的DMEM处理。按上述方法处理后，24、48、72h后分别取各组细胞培养孔内的培养液, 2000r/min, 离心10min,收集各组上清液, 保存于-20℃。按IL-24 ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪450nm处测量各组上清液内MDA-7/IL-24的A值, 根据已测的标准曲线计算出各组相应的浓度值。

6. 肝癌及正常细胞的体外增殖分析：采用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法检测，取对数生长期HepG2、MHCC97L、Hep3B和L02细胞，胰酶消化后，加入培养液吹打混匀，以2×103/孔细胞浓度接种于96孔培养板。每孔加入200μl 5%的DMEM，37℃，体积分数5% CO2条件下培养。24h后分成3组，每组48孔，分别加入无血清DMEM，Ad.vec组(每个细胞1000vp), Ad.mda-7组 (每个细胞1000vp)， Hep3B以每个细胞500vp病毒量感染。每天定时加入20μl 5mg/ml的MTT，37℃孵育4h后吸尽培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl；再次37℃孵育15min后在酶标仪上540nm波长读A值，取A值的算术平均值后计算细胞数分析。

7. 肝癌细胞和正常细胞凋亡检测：采用Hoechst和流式细胞术检测各组细胞的凋亡。Hoechst染色：在6孔板中盖玻片上接种HepG2、MHCC97L、Hep3B和L02细胞至30%满后分成3组，分别加入无血清DMEM，Ad.vec（每个细胞1000vp）和 Ad.mda-7 (每个细胞1000vp)，Hep3B以每个细胞500vp的病毒量感染，48h后，分别用4％多聚甲醛固定30min，反复磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后加入2ml配制好得Hoechst33258溶液，避光染色15min后在奥林巴斯BX60荧光显微镜下观察，以连续计数1000个细胞作为计数结果进行χ2检验。

8. 流式细胞仪检测细胞的凋亡：6孔板中接种HepG2、MHCC97L、Hep3B和L02细胞至30%满后，分成3组，分别加入无血清DMEM，Ad.vec(每个细胞1000vp), Ad.md-7 (每个细胞1000vp)，Hep3B和MHCC97L分别以每个细胞500vp和2000vp的病毒量感染，48h后分别用胰酶收获细胞，用PBS洗后调整细胞浓度为1×106/ml，加入结合缓冲液后取100μl，分别加入5μl磷脂结合蛋白Ⅴ和10μl碘化丙啶（PI）染液，避光作用15min后用流式细胞仪检测（美国Beeton-Dickinson公司的FACS Calibur型流式细胞仪）。

9. 细胞周期增殖活性分析：采用流式细胞分析各细胞周期时相：6cm培养皿中接种HepG2、MHCC97L、Hep3B和L02细胞至30％满后分成3组，用无血清DMEM同步化24h后，分别加入无血清DMEM，Ad.vec（每个细胞1000vp）, Ad.mda-7 (每个细胞1000vp）处理，Hep3B处理同前，48h后用胰酶收获细胞，制成单细胞悬液用PBS洗后调整细胞浓度为1×106/ml，PBS冲洗2次后70%乙醇-20℃固定过夜。检测前用PBS液洗1次后重悬在500μl的PI溶液中。染色30min后进行流式细胞分析。流式细胞仪以氩离子激光作为光源，激光波长488nm。分析后应用DNA细胞周期分析软件Multicycle软件计算DNA组方图G0/G1、S、G2/M期百分比。所得结果经t检验进行统计学分析。

10. 统计学方法：部分数据用x-±s表示，所有数据应用统计学软件SPSS11.0进行方差分析和t检验。

结    果

1. MDA-7/IL-24基因在肝癌和正常细胞中的表达：用PCR方法扩增得到的目的基因片段（IL-24）长约380bp，电泳结果与预期结果相符，见图1。提示腺病毒介导的MDA-7/IL-24的基因已经在肝癌细胞HepG2、MHCC97L、Hep3B和正常的肝细胞L02中表达，同时转染无血清DMEM和Ad.vec的细胞中无表达。

2. ELISA蛋白表达分析结果：24、48h和72h的蛋白表达结果，见表1。提示MDA-7/IL-24蛋白作为一种分泌型蛋白能在4种细胞内表达，而且在72h表达量最高。

3．MDA-7/IL-24基因转移对肝癌和正常细胞增殖的影响：Ad.mda-7能明显抑制HepG2（P＝2.81e-010, P＝3.48e-010）、MHCC97L（P＝6.34e-7, P＝1.12e-6）和Hep3B（P＝2.95e-09, P＝1.46e-08）细胞的生长，但对正常肝细胞L02无明显的抑制作用,见图2。 

4. MDA-7/IL-24诱导肝癌细胞的凋亡：Hoechst33258染色提示MDA-7能促进HepG2、MHCC97L和Hep3B细胞的凋亡，而对于正常的肝细胞L02无明显的影响，见图3。在HepG2、MHCC97L和Hep3B三种肝癌细胞中Ad.mda-7组和对照组和Ad.vec组比较，差异有统计学意义，P<0.01（P＝7.92e-011, P＝7.42e-011），对照组和Ad.vec组比较，差异无统计学意义，P>0.05（P＝0.33）。

5. 流式细胞仪检测细胞凋亡：异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白Ⅴ和PI能很好的将凋亡细胞分选出来。Ad.mda-7的感染能促进肝癌细胞HepG2、MHCC97L、Hep3B的大量凋亡，而对正常的肝细胞L02无促进凋亡的作用,见表2。

6. MDA-7/IL-24基因转移对肝癌细胞和正常细胞周期的影响：细胞周期图经过软件分析后提示Ad.mda-7能引导肝癌细胞G2/M期阻滞，提高G2/M期的比例，48h后各组肝癌细胞的G2/M期的比例均明显升高：HepG2组从对照组的6.4%±0.5%增加至32.3%±3.5%、Hep3B组从3.1%±0.2%增加至45.2%±6.0%、MHCC97L组2.2%±0.2%增加至39.0%±5.0%，而正常的肝细胞L02各组的G2/M期的比例分别为5.5%±0.3%和7.0%±0.7%，提示Ad.mda-7不能阻滞肝细胞L02细胞的增殖。  

讨    论

    目前肝癌临床治疗包括外科手术切除和肝移植，但只有部分患者能得到这些治疗，且术后复发率很高。肝癌的基因治疗是一个可行的方法。目前肝癌的基因治疗包括：抑癌基因的转基因治疗，如利用各种载体转染p53和Rb、反义核酸技术、以自杀基因HSV-tk为代表的药物基因治疗和肿瘤疫苗等。在基因治疗中，已经进入临床试验的基因是p53，部分结果显示该基因具有明显的治疗效果，但是受到肿瘤自身基因的影响，即在p53突变或缺失型的癌肿治疗中效果较好而在野生型中效果较差，因此限制了其应用[4]。同时由于目前的基因治疗在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，即不具肿瘤特异性，限制了其临床应用。因此，探寻既可选择性杀伤肿瘤细胞又对正常细胞无影响，而且不受p53状态限制的治疗方案已成为癌症治疗的研究热点[2-4]。

    Fisher[1]发现，MDA-7/IL-24基因在黑色素细胞中高表达，而在黑色素瘤细胞中低表达，黑色素瘤恶性度与该基因表达水平负相关，将该基因转染入恶性的黑色素瘤细胞后发现它具有强烈的生长阻滞、促凋亡作用及促进分化作用，甚至可以逆转黑色素瘤的恶性[2，3]。事实上，MDA-7/IL-24蛋白低表达甚至缺失与黑色素瘤的侵袭性和疾病的进展有强烈的相关性[1-3]。最初研究表明该基因具有潜在的抗肿瘤作用，当通过腺病毒转染mda-7进入细胞后发现mda-7能选择性的杀死肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)而对正常的细胞（黑色素细胞）无影响[2]。研究发现该基因不仅能引起黑色素瘤细胞生长抑制和凋亡[1-3，5]，而且能促进其他多种癌细胞的生长抑制和凋亡，如肺癌[6]，乳腺癌[7]，胰腺癌[8]，胶质瘤[9]和前列腺癌[10]等。研究表明该基因对正常表皮细胞，肺成纤维细胞，乳腺细胞, 前列腺和肺上皮细胞，星形胶质细胞，内皮细胞及黑色素细胞[1-3, 5-9]等正常细胞均无任何不良反应，从而提示其具备恶性肿瘤选择性。MDA-7/IL-24抑制癌细胞的增长和促进凋亡与这些癌细胞中其它抑癌基因的状态无关(p53、Rb或p16ink4)[2,3,8]，用于癌症治疗不受肿瘤细胞的抑癌基因状态的影响。Mda-7现在被重新命名为IL-24，作为IL-10家族中的一种新的细胞因子[11]。MDA-7/IL-24能激活信号转导活化转录因子3, 说明MDA-7/IL-24是一个前Th1因子[2，3]。这些旁路效应提示MDA-7/IL-24蛋白有包括免疫刺激，抗血管生成和受体介导的细胞毒性[2]，而且能调节凋亡中相互交错的分子和细胞间的信号传导。MDA-7在不同的肿瘤细胞中有着不同促凋亡机制[2]。MDA-7/IL-24的凋亡介质包括caspases、p53、BAX、BAK、TRAIL、Fas和 DR4，介导的凋亡的信号分子包括PKR、p38 MAPK、 PI3K、JNK和GSK-3等[2]。MDA-7/IL-24能增加肿瘤细胞对放射线的敏感性，Mda-7是IL-10家族中惟一的具有杀死肿瘤细胞而对正常细胞无任何毒性作用的多功能细胞因子，因此，MDA-7/IL-24具有极大的临床抗肿瘤应用价值[2]。

    在Fisher教授的指导下，我们成功的构建了携带MDA-7/IL-24的复制缺陷型腺病毒载体并将其转染人正常肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2、MHCC97L和Hep3B，观察其对不同种细胞的不同作用，为该基因应用于肝癌的临床治疗提供理论依据。RT-PCR提示Ad-mda7腺病毒成功地将MDA-7/IL-24转入人正常肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2、MHCC97L和Hep3B中，而对照组和Ad.vec组无MDA-7/IL-24基因的表达。作为一种分泌蛋白，ELISA提供很好的蛋白表达结果，从病毒感染后24、48h和72h的表达结果可以看出，MDA-24/IL-24的蛋白表达与感染时间是相关的，即蛋白的表达随着时间的延长蛋白表达越高，到达72h时明显升高，不排除与肿瘤细胞的凋亡和坏死而使细胞内蛋白溢出到上清液有关。4种细胞感染Ad.mda-7后都有MDA-7/IL-24蛋白的表达，但是引起的效应却完全不同。MTT试验提示该基因转染入细胞后，能明显的抑制肿瘤细胞的生长（HepG2、MHCC97L和Hep3B），与对照组和Ad.vec组比较，差异有统计学意义；同样的剂量转染正常的肝细胞L02后，无论是对照组、Ad.vec组和Ad.mda-7组，3组均没有出现增殖阻滞，差异无统计学意义，和以往的研究一样[1-3]，MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞的增殖在G2/M期，结果显示：Ad.mda-7干预后，肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B细胞的G2/M期细胞显著性的增加，提示MDA-7/IL-24能阻滞肝癌细胞的增长，然而对于正常的肝细胞L02，MDA-7/IL-24的干预后，差异无统计学意义，仅仅增加G2/M期细胞1%。Ad.mda-7能明显地促进肝癌细胞的凋亡。利用Annexin-Ⅴ和PI双染后流式细胞仪检测和Hoechst33258染色后荧光显微镜观察，Ad.mda-7能明显的促进肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B细胞的凋亡，与对照组和Ad.vec组比较，差异有统计学意义。结合ELISA蛋白的检验结果，研究发现随着蛋白浓度的升高凋亡细胞的比例也升高，经过相关性检验二者具有明显的相关性，同时发现病毒感染后随着时间的延长凋亡率明显增加。而正常的肝细胞L02，尽管蛋白量的表达和肝癌细胞一样增加，3组处理差异无统计学意义，提示MDA-7/IL-24并不能促进正常肝细胞的凋亡。HepG2是一种野生型P53肝癌细胞株，MHCC97L是上海复旦大学肝癌研究所分离出来的具有p53突变型基因的具有转移性潜能的肝癌细胞株[12，13]，而Hep3B是一种p53缺失型肝癌细胞株，在Ad.mda-7感染后都能明显的促进3种不同p53状态的肝癌细胞凋亡和增殖阻滞，MDA-7/IL-24能选择性杀死肿瘤细胞而与肿瘤细胞本身的p53状态无关。同时从转染的病毒量来看，p53阴性的Hep3B细胞明显的对MDA-7/IL-24敏感，而p53突变型的MHCC97L能产生更多的抵抗性，但是和对照组比较，差异有统计学意义（转染细胞的病毒量是根据48h后能导致30%～50％细胞产生凋亡的量来决定的）。因此，Ad.mda-7能介导MDA-7/IL-24在正常的肝细胞和肝癌细胞中表达，过表达MDA-7/IL-24能明显的促进肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B的凋亡，阻滞其增殖，而且其促进肝癌细胞的凋亡和增殖阻滞与细胞的p53抑癌状态无关。而对正常的肝细胞L02却无任何的毒性作用。因此，Ad.mda-7能选择性的杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞不产生毒性作用，提示Ad.mda-7在理论上具有治疗肝癌的作用，为肝癌的基因治疗提供了一个新的希望。

    志谢  美国哥伦比亚大学Fisher教授在百忙中多次在关键技术上给予指导；同济医院儿科肾病研究室周建华教授对本研究给予技术指导及实验设备支持

参  考  文  献

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