大鼠肝脏癌变过程中环氧合酶2表达与肿瘤血管生成的关系

 

【摘要】  目的  探讨环氧合酶-2（COX-2）表达与肝癌血管生成之间的关系。 方法  将40只Wistar大鼠分为模型组（30只）和正常对照组（10只），用0.01%二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠实验性肝癌，于诱癌第6、12、18周分批处死实验大鼠，常规制作肝脏病理切片。用免疫组织化学法检测大鼠肝脏癌变过程中不同时期的COX-2、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体2（VEGFR2／KDR）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和微血管密度（MVD）的表达情况。 结果  实验第6、12、18周，模型组大鼠肝脏呈现典型的脂肪变性炎性细胞浸润、肝硬化、肝癌的病理变化；肝脏COX-2、VEGF、KDR、MMP-2在大鼠肝脏癌变过程中表达明显增强；MVD值在肝癌期明显升高，MVD与VEGF、KDR、MMP-2之间存在着显著的正相关（r值分别0.858、0.788、0.684，P值均<0.01），COX-2表达与VEGF、KDR、MMP-2及MVD值之间也均具有显著的正相关性（r值分别为0.771、0.599、0.690、0.788，P值均<0.01）。 结论  COX-2在大鼠肝脏癌变过程中具有促进肿瘤血管生成的作用，这可能是COX-2导致肿瘤发生与发展的重要机制之一。

【关键词】  癌，肝细胞； 肿瘤，血管组织； 内皮生长因子； 环氧合酶2

 

【Abstract】    Objective    To explore the relationship between the expression of cyclooxygenase-2（COX-2） and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Methods    Forty Wistar rats were divided into two groups: a model group (30 rats) and a normal group (10 rats).  Hepatocellular carcinoma was induced with 0.01% diethylnitrosamine (DEN) in the model group rats. The rats were sacrificed in batches at the 6th, 12th and 18th week of the experiment. Histological sections of liver tissues were made using routine methods. The expressions of COX-2, VEGF, VEGFR-2/KDR, and MMP-2 protein in the liver tissues were evaluated using immunohistochemical methods. Results    In liver sections from the model group there were marked pathological changes (steatosis, cell infiltration, cirrhosis and liver cancer). The expressions of VEGF, VEGFR-2/KDR, and MMP-2 in those liver tissues were remarkably increased during the hepatocellular carcinogensis. Microvessel density (MVD) was also obviously raised during the process of the cancer development. There was a direct correlation between the MVD and VEGF/KDR/MMP-2 (r = 0.858, 0.788, 0.684, respectively; all P < 0.01). There was also a direct correlation between the COX-2 and VEGF/KDR/MMP-2/MVD (r = 0.771, 0.599, 0.690, 0.788, respectively; all P < 0.01). Conclusion    COX-2 can promote tumor angiogenesis during rat hepatocellular carcinogenesis. This may be one of the mechanisms in which COX-2 promotes carcinomas.

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;   Neoplasms, vascular tissue;   Endothelial growth factors;   Cyclooxygenase-2

 

    近期研究表明，多种肿瘤组织中均可检测到环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，提示COX-2与肿瘤的发生与发展存在着密切的关系。前期研究也表明，COX-2参与了大鼠肝癌的发病过程[1]。然而，COX-2在大鼠肝脏癌变过程中的作用机制目前尚不清楚。本研究进一步分析了COX-2表达与肿瘤血管生成之间的关系，以探讨COX-2促进肝癌发生的作用机制。

                                     材料与方法

1. 主要试剂：二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN），美国Sigma公司产品；山羊COX-2单克隆抗体（SC-1746）、小鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体（SC-7269）、小鼠VEGF受体2（VEGFR-2/KDR）单克隆抗体（SC-6251）和小鼠基质金属蛋白酶-2（matrix metaloproteinases-2，MMP-2）单克隆抗体（SC-13595）均为美国Santa Cruz公司产品；血管Ⅷ因子（ZA-0111）和免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。

2. 大鼠肝癌模型建立与标本收集：雄性Wistar大鼠40只，体重（160±10）g，购于山东大学动物实验中心。大鼠分笼饲养，适应性饲养1周后随机分为实验组（30只）和对照组（10只）。新鲜配制0.01% DEN溶液，供实验组大鼠自由饮用，颗粒饲料喂养。实验14周时，停用DEN，改为正常饮水；对照组饮水不加DEN。诱癌过程中实验组大鼠死亡4只。诱癌第6、12周，分别处死大鼠6只和8只，第18周处死全部大鼠。从肝脏病变明显处取材，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。对照组大鼠取材方法相同。

3. 免疫组织化学染色：用免疫组织化学S-P法检测大鼠肝脏COX-2、VEGF、KDR、MMP-2和血管Ⅷ因子的表达。COX-2、VEGF、KDR和MMP-2用抗原修复液微波处理，Ⅷ因子用胰酶消化进行抗原修复，工作浓度均为1∶50。其余步骤按试剂盒说明书操作。磷酸盐缓冲液代替第一抗体作阴性对照。

4. 免疫组织化学结果判断：COX-2、VEGF、KDR、MMP-2和Ⅷ因子免疫组织化学染色均以细胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，COX-2结果评分参照文献[2]，用半定量法结合COX-2阳性细胞百分比，及阳性细胞染色强弱两个方面计算。VEGF、KDR和MMP-2则在高倍镜下（×400）对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计1 000个，计算阳性细胞的百分数。微血管密度（microvessel density，MVD）计数参照Weidner[3]方法进行。先在低倍镜下（×40）选择微血管分布高密度区，再在高倍镜（×200）下计数被Ⅷ因子染成棕黄色的血管数，结果用5个200倍视野下血管数的平均值表示。

5. 统计分析：病变不同阶段各变量的组间两两比较采用SNKq检验；COX-2及MVD与各变量之间的关系采用Spearman相关分析，部分数据用x-±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

                                    结    果

1．诱癌实验结果：正常肝脏表面光滑有光泽；诱癌第6周，肝表面增粗，失去光泽；第12周，出现粟粒到黄豆大小的结节；第18周，癌肿形成，肝体积明显增大，表面凹凸不平，结节大小不等，与周围组织粘连明显，部分可见血性腹水及肺部转移。各期组织切片经HE染色证实，符合肝脏炎性病变、肝硬化和肝癌的演变过程。

2．COX-2、VEGF、KDR及MMP-2在大鼠肝脏癌变过程中的表达：诱癌第6周即可见COX-2蛋白的微弱表达；12周时表达增强；诱癌晚期，绝大多数肝癌组织均可见COX-2表达，而正常肝组织未见COX-2表达[1]。VEGF、KDR和MMP-2在大鼠肝脏癌变过程中的表达情况基本相似，在正常肝组织及诱癌早期，阳性细胞表达较少，中期表达增强，晚期癌组织呈弥漫性表达（图1～4，表1）。VEGF、KDR和MMP-2组间差异除VEGF和KDR的正常对照与早期诱癌组之间无统计学意义外（q＝2.67，P>0.05），均具有统计学意义（q值为4.46～30.19，P值均<0.01）。

3．肿瘤MVD值计数：Ⅷ因子在正常大鼠及诱癌早期的肝组织表达量极低，在诱癌第12周表达有所增加；而在肝癌期表达最明显（图5），MVD值与各组相比差异有统计学意义（q值分别为21.80、18.10、16.63，P均<0.01），见表1。

4．MVD与VEGF、KDR、MMP-2之间的关系：在肝脏癌变过程中，MVD与VEGF（r＝0.859，P< 0.01）、MVD与KDR（r＝0.788，P<0.01）和MVD与MMP-2（r＝0.684，P<0.01），表达均具有显著的正相关。

5．COX-2与VEGF、KDR、MMP-2和MVD表达之间的关系：相关分析显示，在肝脏癌变过程中，COX-2与VEGF（r＝0.771，P<0.01）、COX-2与KDR（r＝0.599，P<0.01）、COX-2与MMP-2（r＝0.690，P<0.01）和COX-2与MVD（r＝0.788，P<0.01），表达均具有显著的正相关。

                                      讨    论

    VEGF通过与血管内皮细胞上的受体尤其是与KDR结合而发挥作用[4]。大量研究证明，VEGF是目前已知作用最强的血管生成正性调节因子，它特异性地作用于内皮细胞而促进其分裂增殖，表达和分泌多种蛋白酶，降解血管基底膜和细胞外基质，并可诱导内皮细胞生成和释放碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），显著增强包括bFGF在内的多种血管生成因子的促血管生成效应。同时VEGF可使血管通透性增加，血浆蛋白外渗增多，不仅为血管生成提供了基质，而且也为肿瘤细胞生长提供了良好的微环境。另外VEGF还可通过诱导Bcl-2、survivin等抗凋亡分子的表达而抑制内皮细胞凋亡。

    MMPs是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶，通过降解细胞外基质及血管基底膜而促进肿瘤细胞侵袭周围组织，同时它可促进血管内皮细胞的变形、增殖和迁移，促进血管生成后期基底膜和管腔的重建[5]。另外，MMPs还参与释放以前体形式结合在细胞膜上的多种细胞因子和生长因子，影响细胞信号传导和细胞功能，促进血管生成。组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloprotienase，TIMP）是基质金属蛋白酶的天然抑制物，其主要功能是对MMPs发挥抑制作用，调节细胞外基质代谢，MMPs与TIMP之间的平衡有利于维持体内血管形成的稳定性。

    MVD检测是采用一定的特异性抗体标记肿瘤组织中血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，用来反映肿瘤组织的血管生成情况。

    本研究结果显示，正常肝组织中无COX-2蛋白的表达，但是在肿瘤诱导剂DEN的作用下，COX-2开始表达，并且在肝癌逐渐形成的过程中表达不断增强，肝癌形成时达高峰。同样，VEGF、KDR、MMP-2在大鼠肝脏的癌变过程中，表达由弱变强，MVD与VEGF、KDR、MMP-2之间存在的高度相关性，说明它们参与了肿瘤血管形成。同样，COX-2与MVD之间以及COX-2与VEGF、KDR、MMP-2之间所显示出的良好相关性，提示COX-2不仅参与了大鼠肝癌的发病过程，而且促进了肿瘤血管的生成。同时，肿瘤新生血管的形成又为肿瘤细胞的进一步浸润创造了条件。两者互为因果，共同促进了肿瘤细胞的生长、浸润和转移。上述关于COX-2、VEGF以及MMP-2在肿瘤中的作用及其相互关系，在Xiong等[6]的研究中得到了验证。

    关于COX-2与肿瘤血管形成之间关系的研究目前主要集中在以下几个方面。环氧合酶是分解花生四烯酸生成各种内源性前列腺素过程中的重要限速酶，COX-2高表达使其催化花生四烯酸生成的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）显著增多，PGE2通过与细胞表面的PGE2受体EPs结合或通过核受体过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）直接进入核内，诱导多种血管生长因子尤其是VEGF、MMP-2等的表达，促进了肿瘤血管生成。同时，COX-2基因通过核受体（如PPARδ）可直接作用于VEGF基因，诱导VEGF mRNA和蛋白表达水平的上调[7，8]。VEGF升高又可上调COX-2蛋白的表达和活性[9]，从而使COX-2与VEGF之间形成一种正反馈调节，共同促进了肿瘤血管形成。Shin等[10]的研究发现，烟碱可以刺激胃癌细胞株增殖，促进肿瘤血管生成和肿瘤细胞侵袭与转移，这种作用可被选择性COX-2抑制剂SC-236和VEGFR抑制剂阻断，说明烟碱促进肿瘤细胞增殖和血管生成的作用依赖于COX-2和VEGF/VEGFR-2。

COX-2也可上调基质金属蛋白酶及其他血管生成因子的表达，激发一系列与肿瘤血管生成有关的反应，促进肿瘤血管的形成。Attiga等[11]发现，非甾体消炎药布洛芬和选择性COX-2抑制剂NS-398能够在体外抑制人前列腺癌细胞株DU-145和PC-3分泌MMP-2和MMP-9酶原及MMP-9，使MMP-2、MMP-9的水平下降，但不能改变TIMPs的水平，说明前列腺癌细胞株是通过COX-2上调了MMPs的表达，导致MMPs与TIMPs的平衡失调，促进了肿瘤细胞增殖和肿瘤血管形成。

    另外，COX-2促进细胞增殖抑制细胞凋亡的作用本身也有利于肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移，从而进一步促进了肿瘤血管的形成。

    总之，COX-2不仅参与了大鼠肝癌的发生与发展，而且在肿瘤的生长过程中促进了肿瘤血管生成，这可能是COX-2导致肿瘤发生与发展的重要机制之一。同时，本研究的结果为利用COX-2抑制剂进行防治肝细胞肝癌的研究提供了实验依据。

参  考  文  献

1  Xie YH, Yuan MB. The expression and significance of cyclooxygenase-2 during hepatocarcinogenesis in rats. Shandong Daxue Xuebao(Yixueban), 2005, 43: 602-604, 608.

谢英慧,袁孟彪.环氧化酶2在大鼠肝脏癌变过程中的表达及意义．山东大学学报（医学版）,2005,43:602-604,608．

2  Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. COX-2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors. Cancer, 2000, 89: 2637-2645.

3  Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors. Breast Cancer Res Treat, 1995, 36: 169-180.

4  Zheng S, Han MY, Xiao ZX, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor expression and neovascularization in colorectal carcinoma. World J Gastroenterol, 2003, 9: 1227-1230.

5  Seandel M, Noack-Kunnmann K, Zhu D, et al. Growth factor-induced angiogenesis in vivo requires specific cleavage of fibrillar type I collagen. Blood, 2001, 97: 2323-2332.

6  Xiong B, Sun TJ, Hu WD, et al. Expression of cyclooxygenase-2 in colorectal cancer and its clinical significance. World J Gastroenterol, 2005, 11: 1105-1108.

7  Seno H, Oshima M, Ishikawa TO, et al. Cyclooxygenase 2- and prostaglandin E(2) receptor EP(2)-dependent angiogenesis in Apc(Delta716) mouse intestinal polyps. Cancer Res, 2002, 62: 506-511.

8  Glinghammar B, Skogsberg J, Hamsten A, et al. PPARdelta activation induces COX-2 gene expression and cell proliferation in human hepatocellular carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 308: 361-368.

9  Tamura M, Sebastian S, Gurates B, et al. Vascular endothelial growth factor up-regulates cyclooxygenase-2 expression in human endothelial cells. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87: 3504-3507.

10  Shin VY, Wu WK, Chu KM, et al. Nicotine induces cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor receptor-2 in association with tumor-associated invasion and angiogenesis in gastric cancer. Mol Cancer Res, 2005, 3: 607-615.

11  Attiga FA, Fernandez PM, Weeraratna AT, et al. Inhibitors of prostaglandin synthesis inhibit human prostate tumor cell invasiveness and reduce the release of matrix metalloproteinases. Cancer Res, 2000, 60: 4629-4637.

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