【关键词】肝炎，乙型，慢性； 肝硬化； 转化生长因子β； 大麻素受体1 The expression of cannabinoid receptor 1 in liver tissue of chronic hepatitis B patients involved in liver fibrosis YE Li-hong,WANG Chong-kui, LIU Yun-yan, LIU Yu-zhen, LU Jian-hua, ZHAO Zhao-xia, YANG Li, LI Bing-shun, JIANG Hui-qin, DAI Er-hei. 【Key words】Hepatitis B, chronic; Liver cirrhosis; Transforming growth factor beta; Cannabinoid receptor 1 【First author’s address】Department of Laboratory, the Fifth Hospital of Shijiazhuang , Shijiazhuang 050021,China Corresponding author: DAI Er-hei, daieh2008@ yahoo.com.cn Salo等[1]和Teixeira-Clerc等[2]先后发现大麻素受体1(CB1R)在慢性肝病发展过程中起着独特作用。为深入研究CB1R在慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化发生、发展过程中的作用，我们用免疫组织化学染色法检测肝组织中CB1R表达情况，分析CB1R半定量评分与纤维化分期、血清转化生长因子（TGF）β1、ALT以及HBV DNA水平等指标的相关性，为今后以CB1R为靶点进行抗肝纤维化治疗提供依据。 一、资料与方法 1．标本收集：收集2008年11月-2009年6月在石家庄市第五医院就诊的CHB患者。所有入选患者血清ALT近半年内均有升高，HBV DNA阴性或阳性；患者均进行肝穿刺活组织检查，并进行病理学肝纤维化分期（S）诊断，诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[3]。另收集同期肝血管瘤或肝内结石患者术中肝组织为正常对照标本。 2. 检测方法：肝组织取材均在彩色多普勒超声引导下通过弹射式组织活检枪取得。肝组织长度均在1.0～1.5cm，取材后立即用10%甲醛溶液固定、常规脱水、石蜡包埋，进行厚度为4μm连续切片。依次进行HE常规染色、Masson三色染色及网状纤维染色。同时留取经多聚赖氨酸处理的组织切片2张，以对肝组织进行CB1R免疫组织化学染色。 3. 免疫组织化学检测：采用SP方法。具体操作步骤如下：组织切片经二甲苯脱蜡入水，磷酸盐缓冲液（PBS） 冲洗3次，枸椽酸盐缓冲液进行抗原微波修复10min，双氧水室温孵育20min；加CB1R第一抗体（1∶150）4℃ 过夜。次日, PBS 冲洗3次, 加试剂1（聚合物辅助剂，购自美国CBI公司）37℃孵育30min， PBS冲洗3次；加试剂2（山羊抗兔/小鼠IgG多聚体，购自美国CBI公司）37℃孵育30min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染。CB1R单克隆抗体购自美国Cayman Chemical公司, PV-9000免疫组织化学试剂盒及DAB显色液均购自北京中杉生物技术有限公司。并设阳性对照（已知阳性片）及阴性对照（用PBS代替第一抗体）。 4．血清学指标检测：所有患者于肝穿刺前两日内空腹抽取静脉血5ml，快速离心分离血清用于ALT、HBV DNA定量检测。HBV DNA定量采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测，试剂盒购自广州中山达安基因有限公司。ALT水平采用雅培公司产C8000型全自动生物化学分析仪测定，试剂购自日本和光纯药工业株式会社。部分血清于EP管－70℃冻存备用，统一采用酶联免疫吸附试验检测血清TGFβ1含量。 5．图像分析及CB1R半定量评分：用北京中科恒业ZKPACS病理图文报告分析系统，每张切片于200倍光学显微镜下，随机观察至少包括5个汇管区在内的视野，通过染色强度及阳性细胞数进行综合评分，对CB1R进行半定量分析。染色强度分数标准：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数判定标准：计数阳性细胞数所占比例，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两类标准进行乘积，3分为“+”，4分为“++”，5分以上为“+++”［4］。 6．统计学分析：计量资料采用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS13.0统计软件包对数据进行直线相关分析与单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1. 标本收集结果：共收集118例CHB患者肝组织标本，其中男87例，女31例，年龄13～70（29.3±8.9）岁。经病理学诊断S1期31例，S2期34 例，S3期29例，S4期24例。收集正常对照肝组织标本5例。 2．肝组织CB1R的表达情况：在5例正常对照肝组织中，4例无CB1R阳性表达，仅1例肝组织肝窦内可见数个肝星状细胞（HSC）及肝细胞质弱表达（为肝内结石患者）。而在118例CHB患者肝组织中，CB1R主要表达于肝窦内活化的HSC、纤维间隔及汇管区内肌成纤维细胞、肝窦内皮细胞。另外，在汇管区及小叶内新生毛细血管和炎症坏死灶、炎症坏死灶旁肝细胞及汇管区旁肝细胞质有少量表达。 3．肝纤维化分期与CB1R评分的相关性分析：不同肝纤维化分期CB1R阳性表达评分的差异有统计学意义（F＝10.085，P＜0.01），其中S2、S3、S4期与S1期比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；S4期与S2期比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着肝纤维化分期的提高，CB1R阳性表达水平也逐渐增加，积分逐渐升高。结果图略。 4. CB1R评分与血清TGFβ1、ALT、HBV DNA水平的相关性分析：CB1R的阳性表达积分与血清TGFβ1水平具有显著相关性（r＝0.462，P＜0.01）；与ALT水平具有一定相关性（r＝0.257，P＜0.05）；与HBV DNA载量无相关性（r＝0.038，P＝0.787）。 表1 不同肝纤维化分期与大麻素受体1评分的关系（x-±s） 纤维化分期 例数 大麻素受体1评分(分) S1 31 2.250±1.96 S2 34 4.813±2.48a S3 29 6.250±1.90a S4 24 8.050±4.61ab F值 10.085 P值 0.000 注：a 与S1比较，P＜0.05；b 与S2比较，P＜0.05 三、讨论 正常情况下肝组织中也有CB1R表达，但处于低水平状态。在本研究中，通过对5例正常肝组织进行检测，发现其中4例肝组织无CB1R表达，仅1例肝组织可见数个肝窦HSC及肝细胞质弱表达。而在118例CHB患者肝组织中，CB1R则主要表达于肝窦内活化的HSC、纤维间隔和汇管区内的肌成纤维样细胞、血管内皮细胞，在炎症坏死灶、炎症坏死灶旁肝细胞也均有表达。Teixeira-Clerc等[2]在对人肝纤维化组织进行免疫组织化学染色时，发现肌成纤维样细胞的CB1R明显上调。目前认为HSC是细胞外基质的主要来源细胞和肝纤维化发生的中心环节，当HSC被激活后即转化为肌成纤维样细胞，其活化及增殖在肝纤维化的形成和发展过程中起了关键作用[5]。本研究结果显示，随着肝纤维化分期的提高，CB1R阳性表达量也逐渐增加，进一步证实在肝纤维化的进程中内源性大麻素受体1的表达发生了改变，这可能与肝纤维化的进展有关。 本研究结果显示，肝组织中CB1R表达水平与血清TGFβ1水平呈正相关性。TGFβ1是公认的激活HSC最重要的细胞因子之一，其表达水平与肝纤维化密切相关。对急性肝损伤小鼠模型的研究结果显示，CB1R的激活可以诱导TGFβ1的产生，进而激活HSC。而使用CB1R拮抗剂利莫那班后肝纤维化程度减轻，肝脏TGFβ1表达和纤维生成细胞的数量减少[2]。因此，推测肝组织损伤时可以导致HSC中CB1R表达增强，CB1R表达增强引起TGFβ1分泌增加，进一步激活HSC，促进HSC表型向肌成纤维样细胞转化。即CB1R、TGFβ1和HSC三者存在连锁激活效应，具有协同致肝纤维化作用。 本研究同时分析了CB1R表达水平与血清HBV DNA、ALT水平的关系，结果显示CB1R与HBV DNA之间无相关性，这与乙型肝炎的发病机制相一致。HBV DNA水平反映病毒的复制状况，但不能反映肝脏的纤维化程度。CB1R评分与血清ALT水平有一定相关性，考虑血清ALT升高一般反映肝细胞炎症坏死情况，炎症坏死可造成纤维化进展，而肝细胞肿胀细胞膜通透性增加也可造成ALT水平的升高，但不一定引起肝纤维化的发生，因此，血清ALT水平与肝组织CB1R表达水平相关性较低。 综上所述，在慢性肝损伤发生时，HSC及肌成纤维样细胞表达CB1R增强，CB1R可能通过促进TGFβ1的产生，进一步诱导HSC的增殖、活化，进而促进细胞外基质的合成与分泌，通过该连锁激活效应，最终造成肝纤维化不断进展。因此，内源性大麻素及其受体在肝纤维化发生、发展过程中发挥了促进作用。但是，CB1R上调后通过何种机制与HSC、TGFβ1相互作用，有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]Sato S, Kitamura H, Ghazizadeh M, et al.Occurrence of hyaline droplets in renal biopsy specimens: an ultrastructural study. Med Mol Morphol, 2005, 38: 63-71. [2]Teixeira-Clerc F, Julien B, Grenard P, et al.CB1 cannabinoid receptor antagonism: a new strategy for the treatment of liver fibrosis. Nat Med, 2006, 12: 671-676. [3]Chinese Society of Hepatology and Chinese Society of Infectious Diseases; Chinese Medical Association. The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B.Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 881-891. (in Chinese) 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.中华肝脏病杂志,2005,13:881-891. [4]Gao X, Guo Y, Liu HY, et al. The expression of cannabinoid receptor 1 in fibrotic liver tissues of mice infected with Schistosoma mansoni. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2007, 15: 389-390. (in Chinese) 高啸，郭燕，刘红艳，等.血吸虫性肝纤维化小鼠肝组织中内源性大麻素1受体的表达.中华肝脏病杂志,2007,15:389-390. [5]Dooley S, Delvoux B, Lahme B, et al.Modulation of transforming growth factor beta response and signaling during transdifferentiation of rat hepatic stellate cells to myofibroblasts. Hepatology,2000, 31:1094-1106. （收稿日期：2010-02-24） （本文编辑：朱红梅） 中华医学会肝脏病杂志版权 |