【关键词】肝炎病毒，乙型； 转录因子； 基因，调节； 肝炎，重型 Regulation of HBV transcription and replication and severe acute exacerbation of chronic hepatitis B TANG Hong, CHEN En-qiang. 【Key words】Hepatitis B virus; Transcription factors; Genes, regulator; Hepatitis, severe 【First author’s address】Center of Infectious Diseases, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China Email: htang6198@hotmail.com 乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性传染病。我国是乙型肝炎高发区，每年有1%的乙型肝炎患者发生重型肝炎，其病情严重；由于乙型肝炎从轻症发展至重症之重症化过程的分子机制目前尚不甚清楚，缺乏特异、有效的治疗手段，故病死率极高[1]。因此，HBV引起的重型肝炎是目前和今后相当长时间内临床乙型肝炎防治工作所面临的巨大挑战。 HBV所致重型肝炎的发病机制十分复杂，主要由病毒复制和宿主应答及其相互作用所致。一般认为，HBV在一定条件下引起宿主的免疫反应异常是重型肝炎发病机制的主要环节；其病理基础是肝细胞的严重变性和大量坏死，从而导致肝细胞功能的衰竭。但迄今，对HBV在什么条件下、通过何种机制诱发激活过强的肝细胞免疫杀伤作用，还远远未能阐明。本文就有关宿主转录因子特别是肝富集转录因子对HBV转录复制的调控及其在乙型肝炎重症化发病机制中的可能作用作一简要概述。 1. HBV基因转录与病毒复制的调控：HBV具有非常独特的复制机制，即其基因组首先要转录成RNA即前基因组RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，然后再通过逆转录机制进行复制。HBV基因组的转录是病毒复制过程中最关键的步骤，并受到精细的调控。HBV基因组全长3.2kb，具有4个启动子和2个增强子（EnhⅡ/Cp、PS1p、Sp和EnhⅠ/Xp），分别调控3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7 kb HBV mRNA的转录，并进而编码合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBxAg[2]。 HBV的生活周期涉及病毒进入细胞，HBV DNA进入胞核形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），HBV RNA转录，HBV DNA复制，HBV病毒的包装、成熟和排泌等过程。HBV进入肝细胞后脱去核壳，HBV基因组DNA进入细胞核。首先，以负链DNA为模板延长正链并修补，封闭正链中的裂隙，形成cccDNA。然后，以cccDNA为模板，在宿主RNA聚合酶的作用下转录生成上述几种不同长短的RNA。其中，除编码合成HBcAg、HBeAg和DNA多聚酶外，3.5 kb前基因组RNA还具有一个重要功能，即作为病毒逆转录复制的模板。在病毒复制过程中，HBV DNA多聚酶结合于3.5 kb前基因组mRNA 5′端ε茎-环结构，形成RNA/多聚酶复合物，并被核心抗原多肽二聚体包裹成未成熟的核壳体。在核壳体内的HBV DNA多聚酶催化下，以3.5 kb前基因组RNA为模板，逆转录合成负链HBV DNA，再以负链DNA为模板合成正链HBV DNA。最终形成子代的不完全双链环状DNA。因此，HBV基因组（尤其是3.5 kb前基因组）RNA转录的调控是病毒生活周期中至关重要的环节。 HBV的复制涉及基因转录和基因转录后双重水平，以及多个环节的调控作用。其中，HBV基因转录受HBV启动子和增强子活性的影响，亦受多种泛嗜和肝富集转录因子的调控[2-3]。用含HBV启动子的报导基因体系，已发现一系列对HBV启动子具有调控作用的顺式调控序列和反式调控因子，它们可通过调控HBV的基因转录而影响病毒的复制[4-7]。研究表明，3.5 kb前基因组RNA的水平主要受存在于HBV基因组EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp区域的顺式调控序列的调控[5]。在HBV EnhⅠ/Xp中已证实的转录因子结合位点存在于核苷酸1000~1250位的区域，该区域位于HBV 3.5 kb RNA转录起始位点的上游550~800位核苷酸处；能与EnhⅠ/Xp结合的转录因子包括CCAAT-增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP）、肿瘤抑制蛋白P53、肿瘤抑制蛋白P73、干扰素调节因子（interferon regulation factor，IRF）、核因子NF1、肝富集转录因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）3与4、维甲类X受体（retinoid X receptor，RXR）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）、小鸡卵白蛋白上游的启动转录因子（COUPTF）、调节因子X1（regulatory factor X1，RFX1）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP1）、环一磷酸腺苷应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）和转录活化因子1（activating transcription factor 1，ATF1）等[8]。已发现的能与HBV Cp结合的转录因子有Sp1、RFX1、C/EBP、多重转录因子FTF、HLF、腺病毒E4启动子结合蛋白-4（E4BP4）、HNF4、HNF3、RXR、PPAR、COUPTF1和ARP1等，其结合位点位于HBV前C RNA转录起始点上游（-180~-16）的区域[6]。 在HBV RNA转录物中，3.5 kb前基因组RNA是病毒DNA合成的模板，而病毒蛋白产物的水平则与各种HBV DNA转录物的水平相关。因此，HBV基因组的转录是病毒生物合成的主要调控步骤。研究结果显示，若干种肝富集转录因子（如HNF1、HNF3、HNF4、RXRα、PPARα、HLF、FTF和C/EBP等）能与HBV的4个启动子结合，对HBV的转录发挥重要调控作用。而泛嗜转录因子如AP1、RFX1、NF1和Sp1等对决定HBV启动子活性和HBV转录水平也具有重要的协同调节作用。 2. HBV转录复制调控与乙型肝炎重症化：目前认为，重型肝炎发生、发展的“启动或制控点”受病毒（如病毒变异、病毒蛋白、病毒基因型等）和宿主（如细胞免疫、细胞因子、细胞凋亡等）两方面因素的影响；其中，病毒复制是重型肝炎发生和发展的必需条件和病因所在。有研究结果表明,在重型肝炎发病早期,常常存在较活跃的病毒复制，提示病毒因素在乙型肝炎重症化的发生过程中占据重要地位。宿主转录因子的改变、HBV基因变异等都有可能导致HBV转录复制水平的改变而致乙型肝炎重症化。肝富集转录因子是一类具有基因转录调控作用的蛋白质分子，主要存在于肝脏。研究结果显示，位于EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp启动子的HNF4结合位点同时也是RXR/PPAR的结合位点，是调控C启动子活性及3.5kb mRNA转录的重要因子，在HBV高度组织特异性复制表达中可能具有重要作用。我们已有的研究结果显示，HNF在HBV的肝特异性复制表达过程中起重要作用, 是HBV嗜肝性的决定因素之一；HNF4可通过与HBV核心启动子近端的HNF4结合位点结合，增强HBV的转录与复制[4]。 我们用免疫组织化学及原位杂交技术，通过检测各种HBV感染者肝组织HNF4及HNF3水平、HBV DNA复制和HBsAg、HBcAg表达水平，结果显示慢性乙型肝炎患者体内HNF4的表达水平增高，且HNF4的水平与HBV复制水平呈正相关关系[9]。这一方面可能是HBV有增强HNF4表达的作用，另一方面也可能是HNF4水平增高又促进HBV复制。我们进一步对健康人及不同病情的HBV感染者肝组织中HNF4的表达水平进行研究，结果显示它在慢性乙型肝炎、乙型肝炎相关性肝硬化及重型乙型肝炎患者中的表达水平存在差异。另外，有学者用基因芯片对HBV感染患者肝穿刺活组织标本的研究结果表明，HBV感染可导致HNF4、RXR/PPAR、C/EBP等肝富集转录因子基因转录的增加，并可能和肝损伤的发生相关[10]。因此，肝富集转录因子与HBV基因转录调控间的相互作用，有可能在重型乙型肝炎发病机制中扮演重要角色。 3. HBV转录复制调控在重型肝炎相关HBV变异株筛选产生中的作用：HBV具有高度变异的特点，目前发现变异主要发生在S基因或C基因或X基因，有的则可能多个基因区存在突变。HBV在感染者体内以准种形式存在，在环境选择压力下，准种的病毒组合不断变化，引起病毒生物学特点的变化，包括改变病毒的复制能力、致病性及抗原表位等。其结果是一方面引起HBV持续感染而不断诱导肝细胞炎性损害，降低肝脏贮备功能，并增加产生新的HBV基因变异的机会；另一方面变异病毒复制能力的增强及抗原表位的改变，可以引起过度免疫应答反应，造成严重的肝细胞损伤致乙型肝炎重症化[11-12]。近年有关HBV基因突变在乙型肝炎重症化中的作用受到关注。研究结果表明，HBV变异与HBV感染后的临床表现有关且可影响其自然病程，某些HBV变异增加了HBV的复制率并可能与重型肝炎的发生有关[13-15]。 有研究者认为，与重型肝炎有关的HBV变异株筛选产生的机制，可能是由于在某种宿主因子选择压力下，变异株的生长复制水平优于野生株，从而导致变异株过度生长。我们的研究结果显示，在抗病毒免疫反应中肝富集转录因子水平的改变，可能是病毒变异株选择产生的机制之一。因此，转录因子对HBV基因转录复制的调控是否与重型肝炎相关HBV变异株筛选产生有关，值得深入研究。 临床上，部分乙型肝炎患者虽发生血清HBeAg/抗-HBe转换，但HBV DNA仍然阳性，这类患者通常伴有HBV前C区变异株的出现。一般认为，前C RNA和HBeAg合成减少所致的“免疫逃逸”是前C区变异株出现的重要原因。发生于HBV C启动子A1764T和G 4. 小结：乙型肝炎重症化的发生机制是复杂的，目前多数学者认为这是一个多因素作用的结果。HBV感染是重型肝炎发生发展的必需条件和病因所在，而HBV基因组转录与复制又是HBV生活周期的核心环节。因此，从基因转录调控这一新的角度入手，深入研究HBV基因转录调控在乙型肝炎重症化中的作用和机制、重型肝炎相关HBV变异株筛选产生的机制、变异株在转录复制和生物学表型上的特性及其与重型肝炎发生和发展的相互关系，将为寻找预测和监测重型肝炎发生发展的病毒变异和宿主转录因子标志提供线索，为发展重型肝炎治疗的有效手段提供新的作用靶点。 参 考 文 献 [1]Lee WM. 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