【关键词】 自身抗体； 实验室诊断； 肝病，自身免疫性； 癌，肝细胞 Research progress on autoantibodies and liver diseases diagnosis GAO Chun-fang, FANG Meng. 【Key words】Autoantibodies; Laboratory diagnosis; Liver diseases, autoimmune; Carcinoma, hepatocellular 【First author’s address】Department of Laboratory Medicine, Eastern Hepatobiliary Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China Email: gaocf1115@ 163.com 自身免疫性疾病是指机体的自我耐受失控，自身免疫应答过高，产生直接或间接破坏自身组织的自身应答性T淋巴细胞和自身抗体，并引起相应器官组织的病变和功能障碍。由于检测抗原特异性T淋巴细胞技术较为繁琐，临床实验室难于常规开展，因此，自身抗体的检测成为自身免疫性疾病的主要实验室诊断手段。随着分子生物学技术以及免疫学技术的发展，越来越多的与疾病相关的自身抗体被发现。现对自身抗体在自身免疫性肝病中的诊断价值，肿瘤自身抗体的类型和检测方法，以及肿瘤自身抗体在原发性肝细胞癌（HCC）早期诊断中的应用作一介绍。 一、自身抗体与自身免疫性肝病 自身免疫性肝病主要分为自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）和原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）及3种疾病中任意两者组合的重叠综合征，主要以AIH-PBC重叠综合征多见。 AIH临床特点为高γ-球蛋白血症、多种血清自身抗体阳性和对免疫抑制剂治疗应答[1]。根据血清中自身抗体的种类可将AIH分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3个血清亚型[2]。Ⅰ型AIH即经典型，最为常见，约占全部AIH的60%～80%，抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）、抗平滑肌抗体（anti-smooth muscle antibody，SMA）、抗肝细胞膜抗体或非典型性核周型抗中性粒细胞胞质抗体阳性为其特征。Ⅱ型AIH主要发生于儿童，以抗肝肾微粒体Ⅰ型抗体或抗肝细胞胞质Ⅰ型抗体阳性为特征。Ⅲ型AIH是最不确定的类型，以抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（anti-soluble liver antigen antibody/anti-liver pancreas antibody，SLA/LP）阳性为特征。另外，抗去唾液酸糖蛋白受体抗体和抗谷胱甘肽硫转移酶抗体也是AIH相关的自身抗体。其中抗去唾液酸糖蛋白受体抗体特异性较好，很少存在于其他肝病或肝外自身免疫性疾病，且与疾病的活动度相关，可用于判断疾病活动度及监测治疗反应；抗谷胱甘肽硫转移酶抗体虽然在AIH中阳性率仅为16%，但该抗体阳性者往往表现较重，且预后较差，因此这一抗体可用作判断疾病的严重程度和预后评估。 血清自身抗体通常并不具有疾病特异性，如ANA是Ⅰ型AIH的血清学标志，约75%Ⅰ型AIH患者为阳性，但是在慢性病毒性肝炎或其他自身免疫性疾病甚至健康老年人群中亦可有阳性表现[3]。SLA虽然是Ⅲ型AIH的血清标志物，但是50%的Ⅰ型和Ⅱ型AIH也呈阳性表现[4-5]。因此，仅凭借自身抗体并无法鉴别诊断AIH，还需结合患者病史、生物化学和病毒学检测结果进行鉴别诊断。2008年，Hennes等[6]提出AIH的简化诊断标准，将血清IgG水平、ANA、SMA、SLA/LP、组织学特征以及排除病毒性肝炎等纳入诊断标准，其中IgG水平＞ PBC是一种病因不明的慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病，主要影响中等大小的肝内胆管，特别是肝内小叶间胆管，患病者多为中年女性。抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）阳性是PBC的血清学特点，可见于90%～95%的患者，并且可在临床症状和肝功能异常出现前数年出现。大多数病例可通过升高的碱性磷酸酶和AMA阳性确诊。线粒体有多种自身抗原成分，根据AMA的靶抗原在线粒体内膜或外膜上的位置及对胰蛋白酶的敏感性和电泳特征，将其分为9个亚型（M1～M9），因此其抗体AMA也有9个亚型，其中M2、M4、M8和M9与PBC相关，AMA-M2是PBC特异性血清标志物，其敏感性大于90%，特异性达95%以上。AMA-M2伴M4、M8阳性多见于PBC严重患者，AMA-M2伴M9阳性多见于轻型患者及PBC患者的亲属，但AMA几种亚型联合检测PBC的诊断效率并不优于单独的M2检测。除AMA外，PBC患者血清中同样可以检测到ANA的存在，特别是在AMA阴性的PBC患者中，血清总ANA的阳性率可达85%[7]。PBC特异性的ANA主要有抗gp210抗体、抗p62抗体，抗着丝粒抗体以及抗SP100抗体。这些特异性ANA在PBC中的检测灵敏度均不高于30%，但具有较高的特异性，在对于AMA阴性的PBC可能具有辅助诊断意义，且可能与疾病的严重程度和疾病预后相关[8-9]。近来关于抗gp210抗体及抗着丝粒抗体与PBC临床表现相关性的研究表明，肝功能衰竭患者多呈抗gp210抗体阳性，而抗着丝粒抗体阳性者则出现门静脉高压症状[10]。另外，在PBC患者血清中还检测到抗嗜酸性粒细胞过氧化物酶、抗髓过氧化物酶抗体，以及抗酿酒酵母抗体等，这些抗体可以作为PBC诊断的一个参考指标，但其作用机制以及参考价值均有待进一步研究证实。 PSC也是一种病因不明的慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病，可导致肝内、外大胆管的破坏，引起胆汁淤积、肝纤维化和肝硬化。与AIH和PBC不同，PSC主要影响中青年男性。非典型性核周型抗中性粒细胞胞质抗体阳性支持PSC的诊断，在PSC中的阳性率为60%～80%，但是其同样存在于Ⅰ型AIH患者血清中，因此该抗体只是一个非特异性指标，对PSC的诊断意义仍需进一步研究确定[11]。 自身抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法、双向免疫扩散、对流免疫电泳、放射免疫沉淀法等，其中实验室检测最常用的仍是间接免疫荧光法（表1）。酶联免疫吸附法由于操作的简便性和结果的客观性，已越来越受到人们的青睐。 二、肿瘤及炎症中的自身抗体现象 慢性肝炎、肝硬化和HCC患者血清中，也存在自身抗体，而且显著高于正常人。癌症患者体内除了与自身免疫病相关的常见自身抗体外，尚有其他自身抗体。肿瘤本身能诱导机体免疫反应，在癌症发生的初期，人体的免疫系统能监测到一些肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAA）的存在，引起免疫反应，产生肿瘤相关自身抗体，进而在癌症患者血清中就可以检测到这些自身抗体[12]。最早发现的血清TAA来源于对黑色素瘤患者的研究。随后，越来越多的研究证实肿瘤患者血清中存在TAA及其诱导机体免疫系统产生的自身抗体[13]。机体免疫系统对TAA的免疫应答通常发生在癌症形成的早期，以清除癌前期的病变[14]，提示肿瘤相关自身抗体很有可能成为有潜力的癌症早期诊断标志物，为肿瘤的早期非创性诊断提供了新思路。 目前，在多种肿瘤患者中均发现了肿瘤抗原相关的自身抗体，如肝细胞癌中的抗p53抗体和抗p62抗体[15-16]；肺癌中的抗p53、蛋白基因产物9.5、膜联蛋白Ⅰ和Ⅱ抗体[17-18]；乳腺癌中抗P53、HER2/neu、多态性上皮黏液素抗体等[19]；大肠癌中抗GA-733-2、p53、Fas/CD95、MUC 筛选TAA及其自身抗体的方法主要有：重组cDNA表达文库血清学分析法、噬菌体展示技术、蛋白质微阵列、血清蛋白质组学分析、多重亲和蛋白质谱等。其中以重组cDNA表达文库血清学分析法和血清蛋白质组学分析运用最为广泛。 三、HCC的自身抗体研究 甲胎蛋白（AFP）多年来一直作为诊断HCC的首选指标，但AFP在HCC诊断中存在一定的漏诊率和误诊率。肿瘤相关抗原自身抗体的发现为HCC的早期诊断提供了新的思路。HCC早期，患者血清即可出现TAA相关抗体[24]。除p53和p62抗体被广泛确认作为HCC相关的自身抗体外，在HCC血清中还发现多种TAA及其相应抗体。Takashima等[25]应用蛋白质组学结合重组cDNA表达文库血清学分析的方法，发现抗热休克蛋白70、peroxiredoxin和锰超氧化物歧化酶抗体可以作为HCC的候选诊断标志物；Zhou等[26]应用重组cDNA表达文库血清学分析技术发现HCC-22-5抗原在AFP阴性的HCC中阳性率可达78.9%，可作为AFP阴性HCC的血清学指标；Stenner-Liewen等[27]、Uemura等[28]和Le Naour等[29]的研究小组也发现多个HCC相关抗原。但研究结果显示，单个TAA检测的灵敏度较低，不宜作为临床检测指标。Zhang等[30]提出采用筛选出的8个TAA（IMP1、p62、Koc、p53、c-myc、cyclin B1、survivin、p16）联合检测肝癌患者，可使检测的灵敏度大为提高，灵敏度由单个TAA检测的9.9%～21.8%提高至联合检测的59.8%。Li等[31]联合DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3、eEF2、AIF和prostatic binding protein可将I期HCC诊断灵敏度提高至90%。Chen等[32]筛选出两个新的HCC相关性抗原，Sui1和RalA，将其抗体水平和之前Zhang等[30]发现的8个TAA抗体以及AFP联合，可使HCC的诊断灵敏度由59.8%提高至66.2%。这些研究均说明TAA或其抗体在HCC的早期诊断中具有重要价值，而多个指标联合诊断可显著提高诊断灵敏度，在HCC的早期诊断中具有重要的应用前景。 综上所述，血清自身抗体检测在自身免疫性肝病，尤其是AIH和PBC的诊断中占有重要地位。而肿瘤相关性抗原及其抗体的发现，也为肝细胞癌的早期诊断提供了新的思路。但多数自身抗体既无器官特异性，亦无疾病特异性，无法作为疾病鉴别诊断、严重程度评估的核心指标。希望随着基础研究及实验室检验技术的不断发展和提高，能够发现更多新的具有疾病及器官特异性的自身抗体，并与现有指标结合，建立多指标联合诊断模型以提高现有肝病（包括自身免疫性肝病及肿瘤性肝病）的临床诊断水平，从而为肝病患者提供早期诊断和治疗的时机，提高生存质量。 参 考 文 献 [1]Feld JJ, Dinh H, Arenovich T, et al. Autoimmune hepatitis: effect of symptoms and cirrhosis on natural history and outcome. Hepatology, 2005, 42: 53-62. [2]Dalekos GN, Zachou K, Liaskos C, et al. Autoantibodies and defined target autoantigens in autoimmune hepatitis: an overview. Eur J Intern Med, 2002, 13: 293-303. [3]Lyons R, Narain S, Nichols C, et al. Effective use of autoantibody tests in the diagnosis of systemic autoimmune disease. Ann N Y Acad Sci, 2005, 1050: 217-228. [4]Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, et al. Characterisation of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet, 1987, 1: 292-294. [5]Ma Y, Okamoto M, Thomas MG, et al. Antibodies to conformational epitopes of soluble liver antigen define a severe form of autoimmune liver disease. Hepatology, 2002, 35: 658-664. [6]Hennes EM, Zeniya M, Czaja AJ, et al. Simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Hepatology, 2008, 48: 169-176. [7]Muratori P, Muratori L, Ferrari R, et al. Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol, 2003, 98: 431-437. [8]Invernizzi P, Selmi C, Ranftler C, et al. Antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis, 2005, 25: 298-310. [9]Wesierska-Gadek J, Penner E, Battezzati PM, et al. Correlation of initial autoantibody profile and clinical outcome in primary biliary cirrhosis. Hepatology, 2006, 43: 1135-1144. [10]Nakamura M, Kondo H, Mori T, et al. Anti-gp210 and anti-centromere antibodies are different risk factors for the progression of primary biliary cirrhosis. Hepatology, 2007, 45: 118-127. [11]Bartu。nkov J, Tesar V, Sediv A. Diagnostic and pathogenetic role of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies. Clin Immunol, 2003, 106: 73-82. [12]Finn OJ. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more. [13] [14]Tan EM. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in tumorigenesis. J Clin Invest, 2001, 108: 1411-1415. [15]Soussi T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res, 2000, 60: 1777-1788. [16]Lu M, Nakamura RM, Dent ED, et al. Aberrant expression of fetal RNA-binding protein p [17]Brichory F, Beer D, Le Naour F, et al. Proteomics-based identification of protein gene product 9.5 as a tumor antigen that induces a humoral immune response in lung cancer. Cancer Res, 2001, 61: 7908-7912. [18]Brichory FM, Misek DE, Yim AM, et al. An immune response manifested by the common occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL [19]Disis ML, Pupa SM, Gralow JR, et al. High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients with early-stage breast cancer. J Clin Oncol, 1997, 15: 3363-3367. [20]Mosolits S, Harmenberg U, Rud閚 U, et al. Autoantibodies against the tumour-associated antigen GA733 [21]Saleh J, Kreissler-Haag D, Montenarh M. p53 autoantibodies from patients with colorectal cancer recognize common epitopes in the N- or C-terminus of p53. Int J Oncol, 2004, 25: 1149-1155. [22]Reipert BM, Tanneberger S, Pannetta A, et al. Increase in autoantibodies against Fas (CD95) during carcinogenesis in the human colon: a hope for the immunoprevention of cancer? Cancer Immunol Immunother, 2005, 54: 1038-1042. [23]Kocer B, McKolanis J, Soran A. Humoral immune response to MUC [24]Zhang JY, Zhu W, Imai H, et al. De-novo humoral immune responses to cancer-associated autoantigens during transition from chronic liver disease to hepatocellular carcinoma. Clin Exp Immunol, 2001, 125: 3-9. [25]Takashima M, Kuramitsu Y, Yokoyama Y, et al. Proteomic analysis of autoantibodies in patients with hepatocellular carcinoma. Proteomics, 2006, 6: 3894-3900. [26]Zhou SF, Xie XX, Bin YH, et al. Identification of HCC-22-5 tumor-associated antigen and antibody response in patients. Clin Chim Acta, 2006, 366: 274-280. [27]Stenner-Liewen F, Luo G, Sahin U, et al. Definition of tumor-associated antigens in hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2000, 9: 285-290. [28]Uemura M, Nouso K, Kobayashi Y, et al. Identification of the antigens predominantly reacted with serum from patients with hepatocellular carcinoma. Cancer, 2003, 97: 2474-2479. [29]Le Naour F, Brichory F, [30]Zhang JY, Megliorino R, Peng XX, et al. Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 2007, 46: 107-114. [31]Li L, Chen SH, Yu CH, et al. Identification of hepatocellular-carcinoma-associated antigens and autoantibodies by serological proteome analysis combined with protein microarray. J Proteome Res, 2008, 7: 611-620. [32]Chen Y, Zhou Y, Qiu S, et al. Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer Lett, 2010, 289: 32-39. （收稿日期： （本文编辑：黄晨） 中华肝脏病杂志版权 |