【关键词】肝炎,中毒性； 多态性，单核苷酸； 基因NAT2 The association between NAT2 polymorphysim and anti-tuberculosis drug-induced hepatitis WU Yu-mei, LUO Zi-yi, ZHANG Hong-mei, PENG Jing-fu, LIU Sai-yun, WANG Min. 【Key words】Hepatitis, toxic; Polymorphism, single nucleotide; Gene, N-acetylteansferase 2 【First author’s address】Department of Medcine, Shenzhen Third People抯 Hospital, Guangdong Medical College, Shenzhen 518020, China Corresponding author: LUO Zi-yi, Email: luoziyi2001@tom.com 目前造成肝损害最常见的一线抗结核药物是异烟肼，其主要通过N-乙酰化酶代谢，后者由NAT2（N-acetylteansferase 2）基因编码。目前已发现NAT2基因有26种等位基因，存在7个位点的点突变[1]。何种等位基因型或表型与药物性肝损害相关，以及其相关程度目前国内尚鲜见报道。本研究采用实时荧光定量PCR方法，结合Taqman探针的双重特异性定性检测NAT2各位点的点突变，探讨NAT2基因多态性与异烟肼所致肝损害的关系。 一、资料与方法 1. 病例收集及分组：收集深圳市第三人民医院2008年4月-2010年3月住院的经结核菌素纯蛋白衍生物、结核特异性酶联免疫斑点技术、胸片和肺部CT等确诊为结核，使用异烟肼治疗且剂量和方案相同的患者。所有患者按有无肝损害分为病例组和对照组。肝功能损害诊断标准：抗结核治疗前肝功能正常，治疗过程中无其他药物影响（剔除停用利福平后肝损害好转患者）；除外病毒性肝炎及其他病毒感染所致肝损害；ALT（AST）或总胆红素升高（TBil）≥2倍正常值上限（ULN）[2]。病例组按肝损害程度分为病例组1和病例组2，病例组1指2×ULN≤ALT（AST）≤5×ULN或2×ULN≤TBil≤4×ULN的患者，即肝损害较轻组；病例组2指ALT或AST>5×ULN或TBil>4×ULN的患者，即肝损害较重组。所有入选患者未服用其他对肝脏有毒性作用的药物，排除肝脏基础疾病及已有文献报道与NAT2基因有关的疾病[3-4]。所有患者均为汉族人，相互间无血缘关系。 2. 试剂与方法：rTaq酶、dNTP、10×缓冲液购自大连宝生物公司，DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司，实时荧光定量PCR荧光探针和引物均由上海生工生物工程有限公司合成；ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司。 3. DNA样品：收集检测对象外周血2ml，EDTA抗凝，按DNA提取试剂盒提取。 4. 探针和引物：根据NCBI网站上NAT2基因序列，用美国应用生物系统公司引物设计软件对其5个主要突变位点设计引物和Taqman探针，序列见表1。 5. 实时荧光定量PCR检测：体积25μl：高压灭菌水16μl、10×缓冲液2.5μl、2.5mmol/μl dNTP 1μl、10μmol/μl上下游引物各1μl、10μmol/μl野生型探针0.3μl、10μmol/μl突变型探针0.6μl、DNA模板2.5μl、rTaq酶0.1μl，将PCR液振荡混匀加入96孔板中。PCR条件：50℃ 5min，94℃ 2min；94℃ 5s，52℃ 45s，60℃ 45s，40个循环。每组PCR反应均设立阴性对照和阳性对照。 6. 统计学分析：用SPSS11.5软件进行统计学分析，组间率的比较用χ2检验，计量资料（ALT值）用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1. 一般情况：共收集患者317例，病例组155例，对照组162例。317例患者基本情况如下：根据文献[5]将两组人群按年龄、性别、是否吸烟、营养状况、结核初（复）治情况分层，两组间差异无统计学意义，具有可比性（表2）。 2. 临床表现：（1）临床症状和体征：155例肝功能损害患者ALT的均值为227.8U/L（95%可信区间为198.1～257.6U/L），中位值为175.5U/L。其中有20例患者（12.9%）出现临床症状，其中15例患者ALT值>200U/L；主要临床症状包括：纳差16例、乏力11例、恶心或呕吐8例、厌油7例，其他的临床症状尚有腹胀、腹泻、尿黄、发疹、瘙痒。（2）出现肝损害与服药时间的关系：患者在服药后最短1d、最长180d后出现肝功能异常，中位时间为12d，平均时间为28.8d，95%可信区间为22.92～34.73d。在≤2周、2～4周与≥4周出现肝损害患者的基因表型（快乙酰化、慢乙酰化）差异无统计学意义。 3. NAT2基因多态性检测结果：（1）NAT2基因各等位基因频率检测结果：对照组各等位基因*5、*6、*7、*11、*13频率分别是6.2%（10/162）、26.5%（43/162）、29.0%（47/162）、3.1%（5/162）、34.6%（56/162）。病例组1、病例组2及对照组间等位基因*5、*7、*11、*13频率差异无统计学意义。3组人群中*6等位基因频率不同，差异有统计学意义（P<0.05）；病例组1及病例组2中*6等位基因频率均显著高于对照组,差异有统计学意义（P值均<0.05）。含有*6等位基因的患者服用异烟肼出现较轻肝功能损害的可能性是无*6等位基因患者的1.7倍，出现较重肝功能损害的可能性是无*6等位基因患者的1.9倍，见表3。（2）基因表型与肝功能损害易感性的关系：三组间慢乙酰化型频率不同，差异有统计学意义（χ2＝8.9866，P<0.05）。病例组1慢乙酰化型率与对照组比较,差异无统计学意义（χ2＝1.1125, P>0.05）。病例组1与病例组2慢乙酰化率差异无统计学意义（χ2＝2.9723, P>0.05）。病例组2慢乙酰化型频率明显高于对照组，差异有统计学意义（χ2＝8.9776，OR＝2.7590, P<0.05）。NAT2慢乙酰化型患者出现较重肝损害的可能性是快乙酰化型患者的2.7倍，见表4。 表3 各组间等位基因比较（例，%） 组别 例数 282（*13） 341(*5) 481(*11) 590(*6) 857(*7) 病例组1 88 31(35.2) 9(10.2) 2(2.3) 34(38.6)a 29(33.0) 病例组2 67 29(43.3) 10(14.9) 2(3.0) 28(41.8)b 27(40.3) 对照组 162 56(34.6) 10( 6.2) 5(3.1) 43(26.5) 47(29.0) χ2值 1.6497 4.5393 0.1434 6.6463 2.7643 P值 >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 >0.05 注：病例组1：肝功能损害较轻组；病例组2：肝功能损害较重组；与对照组比较，a：χ2＝3.9127，P<0.05，比值比为1.7425；b：χ2＝5.1514，比值比为1.9869, P<0.05 4. 病例组不同位点突变与ALT水平变化的关系：据突变位点不同分组，将各组ALT水平进行比较，差异无统计学意义（P值均>0.05），见图1。 三、讨论 本研究选择NAT2 282、341、481、590和857 5个热点突变位点进行检测[1，3-4，6]。结果显示病例组1、病例组2和对照组三组间NAT2各等位基因* 5、*7、*11、*13频率差异无统计学意义；病例组1、病例组2的*6等位基因频率均高于对照组，提示NAT2*6与异烟肼致肝损害有关。含有*6等位基因的患者服用异烟肼出现较轻肝损害的可能性是无*6等位基因患者的1.7倍，出现较重肝损害的可能性是无*6等位基因患者的1.9倍。Higuchi等[5]报道NAT2*6A是异烟肼肝损害的危险因素，与本研究结果一致。考虑NAT2*6所致N-乙酰化酶活性降低较*5、*7、*11、*13明显，因而NAT2*6可以作为异烟肼所致肝损害的预测因素。 异烟肼在肝内通过N-乙酰化酶代谢为乙酰化异烟肼及毒性较强的乙酰肼和异烟酸，导致肝细胞变性和坏死；代谢过程中生成低分子自由基，也可诱导脂质过氧化反应，引起药物性肝炎[7]。本研究结果提示，慢乙酰化型患者使用异烟肼时更容易出现较重肝损害，其危险性是快乙酰化型的2.7倍，Cho等[8]的研究结果也表明慢乙酰化型是异烟肼所致肝损害的危险因素。以上结果提示N-乙酰化代谢活性减低时，乙酰化过程受阻，易导致异烟肼代谢产物蓄积中毒。为减少药物的蓄积毒性，对于慢乙酰化者可采取隔日顿服给药方式，并严密监测肝功能；同时对快乙酰化型肝功能较好、结核症状较重的患者则可采取每日顿服给药方式以增加药物疗效。 服用异烟肼2周内与超过2周出现肝功能损害患者NAT2基因各位点突变率及慢乙酰化率无明显差异；4周内出现肝功能损害与超过4周出现肝功能损害患者各位点突变率及慢乙酰化率无明显差异；病例组不同位点突变与ALT水平变化无明显关系。这些结果提示尽管NAT2*6及慢乙酰化表型与异烟肼所致药物性肝损害发生有关，但肝功能损害发生早晚及损害严重程度与NAT2基因多态性无明显相关性。可能样本量小，不足以检测出组间差异，应进一步完善大样本研究。结核患者服用异烟肼后发生肝功能损害的平均时间是28.8d，中位时间是12d，因此，建议患者在服药的最初1个月内检查肝功能，有条件者2周内检查可以尽早发现、及时干预。对有乏力、纳差、恶心、呕吐、厌油等消化系统症状患者需警惕肝功能异常的发生。 通过对NAT2基因多态性的检测，对含有*6等位基因和（或）慢乙酰化表型患者采取有效预防措施，制定个体化治疗方案，可减轻或降低肝损害的发生。 参 考 文 献 [1]Hein DW, Doll MA, Fretland AJ, et al. 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