丙型肝炎病毒实验模型和分子病毒学的研究进展

【关键词】肝炎病毒，丙型； 模型，动物； 肝细胞;  微小RNA； 干扰素类

The recent progress on experimental models and molecular

virology of hepatitis C virus   ZHONG Jin.

【Key words】Hepatitis C virus;  Models, animal;  Hepatocytes;  microRNA;  Interferons

【First author’s address】Institute Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200025, China

Email: jzhong@ sibs.ac.cn

HCV是一种有包膜的正链RNA病毒。HCV基因组全长9.6kb，由5′和3′末端的非编码区和一个开放阅读框组成。HCV的5′末端没有加帽，其基因组的翻译依赖于5′-UTR中的内部核糖体进入位点，首先翻译出一个聚合多肽，随后由宿主和病毒自身编码的蛋白酶剪切成熟为至少10种结构蛋白和非结构蛋白。其中结构蛋白包括Core、E1和E2，主要负责病毒的侵入和组装；在非结构蛋白中，p7和NS2参与病毒组装和释放的调控，NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B主要参与病毒基因组复制。其中NS3丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是重要的抗病毒药物靶点，目前已有若干针对这两个酶的小分子抑制剂进入临床药物试验，有望在5～10年内进入市场。现着重介绍以下四个方面的研究进展。

一、HCV研究的实验模型

1. HCV研究的动物模型：HCV的感染具有高度的种属特异性，人是目前发现的惟一自然感染宿主。黑猩猩在HCV感染过程、病理学和免疫学反应与人类比较类似，是目前惟一用于研究HCV感染的实验动物模型，但由于其属于濒临灭绝的动物，加上实验和维护费用昂贵，严重地限制了它在HCV研究中的应用，目前世界上只有少数几个国家能开展黑猩猩的HCV感染工作。

小鼠模型具有遗传背景清楚，繁殖能力强，饲养成本低，实验操作容易等优点，但HCV不能感染小鼠。Meuleman等[1]最近研制出一种含有人肝脏表达尿激酶型纤溶酶激活物的转基因免疫缺陷型小鼠。尿激酶型纤溶酶激活物在肝细胞内的表达可导致小鼠严重的肝损伤，人的肝细胞移植到这种免疫缺陷型小鼠后将产成鼠/人嵌合肝脏，在一定程度上可以支持HCV 的感染和复制，可用于抗HCV药物的评价。但由于这种人源化肝脏的小鼠并不具备人的免疫系统，而HCV感染引发的肝细胞损伤主要是人体免疫反应的结果，因此这种嵌合小鼠模型尚不能用于丙型肝炎的病理学和免疫学研究。目前同时含有人的肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型还处在研发阶段，该模型的实用性将最终取决于人源化小鼠在多大程度上反映了HCV在人体内的感染情况。

2. HCV的细胞模型: HCV的第一个细胞模型是1999年建立的亚基因组复制子模型以及随后建立的全长基因组复制子模型[2]。复制子模型的最大特点是插入一个药物抗性筛选标记到HCV基因组里,通过药物筛选来获得一个能稳定复制HCV基因组的细胞系。复制子模型的建立使得在体外研究HCV RNA的复制成为可能，是一个研究HCV和宿主细胞相互作用的重要工具，并为抗HCV药物的筛选提供了很好的技术平台。但是复制子模型只模拟了HCV生命周期中的RNA复制和病毒蛋白的翻译步骤，即使是全长基因组复制子也不能产生有感染性的病毒颗粒，因此不能用于研究HCV侵入细胞的过程以及病毒的包装和分泌。

2003年HCV的假病毒感染模型成功建立[3]。其原理是绿色荧光蛋白或者荧光素酶标记的人类免疫缺陷病毒或其他逆转录病毒在其病毒表面携带了HCV的包膜蛋白E1和E2。由于携带了HCV的E1和E2蛋白，HCV假病毒能特异性地感染肝细胞，并可通过检测绿色荧光蛋白等标记基因的表达来分析病毒的感染力。HCV假病毒感染模型是研究HCV侵入宿主细胞的重要工具，同时也可用于抗HCV药物的筛选以及HCV中和性抗体效价的评估。

复制子模型和假病毒模型仅模拟了HCV生命周期的部分环节（基因组复制和病毒侵入），因此存在着一定的局限性。Kato等[4]从一个暴发性丙型肝炎患者体内分离到一株基因型2a的HCV病毒株JFH-1，基于JFH-1的复制子可以在肝细胞系中高水平地复制。当转染JFH-1全基因组RNA到肝细胞系（Huh-7）后，可以产生有感染性的病毒颗粒,然而这种病毒的滴度仍然较低，而且在细胞中无法形成持续性感染[5]。与此同时,另外两个美国的研究组使用干扰素信号通路缺陷型的肝细胞系（Huh-7.5.1和Huh-7.5），极大地提高了JFH-1病毒的滴度和感染细胞的能力，而且产生的病毒能够稳定传代和扩增繁殖,从而构建了一个高效稳定的HCV细胞感染模型[6-7]。研究还发现，体外细胞培养产生的 HCV感染性的病毒颗粒能够感染黑猩猩和人源化小鼠，而且来源于感染动物血清的子代病毒还能有效地感染细胞系，从而将HCV体内和体外的研究有机地结合起来[8]。近年来由其他基因型毒株的结构蛋白和JFH-1的非结构蛋白组成的嵌合HCV细胞感染模型被陆续构建[9]。HCV细胞感染模型的建立是HCV研究领域的最重要突破之一,它不但使研究HCV完整的生活周期，尤其是病毒的组装输出等环节成为可能,也为抗HCV特异性药物和疫苗的研发提供了重要的平台。

二、HCV侵入宿主细胞的研究进展

HCV特异性地感染肝细胞，其侵入细胞过程是由细胞表面受体分子介导的细胞内吞作用。HCV的组织亲嗜性可能主要由病毒包膜糖蛋白（E1、E2异二聚体）和其受体分子的相互作用来决定。迄今为止已有多个细胞表面蛋白被认为参与了HCV侵入细胞的过程，其中包括：4次跨膜蛋白CD81,清道夫受体家族成员SR-BI,细胞间紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin,低密度脂蛋白受体（LDL-R），氨基葡聚糖（GAG），凝集素分子DC-SIGN、L-SIGN以及去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。一般认为，CD81，SR-BI，Claudin-1和Occludin是HCV侵入肝细胞的关键受体或辅助受体分子，而LDL-R，GAG，DC-SIGN，L-SIGN和ASGP-R主要通过和HCV病毒颗粒非特异性的结合，促进了病毒颗粒和靶细胞的黏附，从而增加了HCV包膜蛋白和其受体分子的相互作用。

HCV侵入细胞研究方向的最新亮点应该是美国Charles Rice实验室于2006年和2008年用cDNA文库筛选的方法先后发现细胞间紧密连接结构的重要组成蛋白Claudin-1和Occludin是HCV侵入细胞所必须的宿主因子[10-11]。该发现表明细胞间紧密连接很有可能和HCV侵入细胞的过程相关。紧密连接在其他病毒，如柯萨奇病毒侵入细胞的过程扮演了重要的作用[12]，但HCV是如何利用紧密连接来进入宿主细胞的具体机制，尤其是CD81和SR-BI在该过程中是如何与紧密连接协同作用还尚待进一步研究。

Ploss等[11]还发现CD81，SR-BI，Claudin-1和Occludin是HCV侵入靶细胞的充分条件，目前测试过的所有哺乳动物细胞系只要含有人源的这4个分子均能支持HCV的侵入。他们比较了小鼠和人细胞的这4个分子的差异，发现鼠源的SR-BI和Claudin-1在功能上和人源分子无异，均能支持HCV的侵入，但鼠源的CD81和Occludin不能支持HCV的侵入。该发现为HCV小动物感染模型，尤其是通过转基因技术构建HCV感染的小鼠模型指出了一个新的方向。但由于小鼠细胞很可能在HCV生命周期的其他步骤，如病毒RNA复制上仍存在着限制因素，HCV感染的小鼠模型的最终建立还有很长一段路要走。

三、微小RNA(miRNA)在HCV感染细胞过程中的作用

miRNA是一种内源性的、调节性非编码单链RNA，长度为21～23个核苷酸的。miRNA是由pol-Ⅱ聚合酶转录的pri-miRNA经细胞内Drosha, Pasha和Dicer等处理系统剪切成熟，其作用机制主要通过与靶mRNA的互补配对在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制[13]。虽然一般来说miRNA的功能是抑制基因的表达，但报道的与HCV相关的第一个miRNA（即miRNA-122）却能促进HCV的复制。Jopling等[14]研究发现miRNA-122是HCV复制所必须的宿主因子，抑制miRNA-122的表达能显著降低HCV RNA的复制。而且miRNA-122在肝脏组织中高表达，这在一定程度上解释了HCV的肝脏组织亲嗜性。随后的研究发现miRNA-122是通过作用于其在HCV的5′-UTR中的靶位点从而促进了核糖体和HCV的内部核糖体进入位点的结合形成翻译起始复合体，最终提高了病毒蛋白的翻译水平[15]。

Pedersen等[16]发现干扰素除了诱导常见的干扰素激活基因（ISG）的表达外，还能够诱导miRNA-122的下调和其他miRNA的上调，其中至少8个miRNA (miR-1, miR-30, miR-128, miR-196, miR-296, miR-351, miR-431和miR-448)的潜在靶位点位于HCV的RNA基因组里。通过转染实验在肝细胞里同时降低miRNA-122的表达和增加5个miRNA（miRNA-196，miRNA-296，miRNA-351， miRNA-431和miRNA-448）的表达能有效地抑制HCV的复制，而且抑制程度接近于干扰素的作用效果[16]。该结果说明干扰素抑制HCV复制的效应主要是通过对与HCV复制相关的miRNA的调节来实现的。这个发现在干扰素抗病毒领域里提出了一个全新的概念：干扰素不但能诱导经典的具有抗病毒活性的蛋白的表达，还能够诱导miRNA的表达变化来抑制病毒，因此miRNA也是一种ISG。

最近，miRNA在HCV感染过程中所起的作用受到了质疑。Sarasin-Filipowicz等[17]发现HCV在体内的复制水平和miRNA-122的表达水平没有明显的正相关关系。而且肝脏组织中miRNA-122的表达水平低的丙型肝炎患者的HCV血清滴度不但不低，而且对干扰素治疗的应答效果比miRNA-122的表达水平高的患者更差。他们还质疑了先前报道的干扰素上调miRNA在HCV感染过程中所起的抗病毒作用，因为很多这些miRNA在人体内的诱导倍数有限或表达水平太低，不足以行使正常的生物学功能[17]。miRNA在HCV感染过程中所起的具体作用以及该作用的实际生理学意义还需进一步地研究。

四、HCV和宿主细胞干扰素信号通路的相互作用的研究进展

HCV和宿主细胞先天性免疫反应的相互作用一直是本领域研究的一个热点，尤其在HCV如何抑制宿主抗病毒反应使得病毒感染慢性化上面有不少突破性进展。双链RNA（ds-RNA）能通过两个不同的病原体识别系统来激活干扰素的表达：Toll-like受体3（TLR3）和RIG样受体-Ⅰ。TLR3和RIG样受体-I识别ds-RNA后，分别通过Trif和MAVS激活下游的干扰素调节因子3分子，激活后的干扰素调节因子3二聚化后进入细胞核，从而激活β-干扰素的表达。产生的β-干扰素分泌到细胞外后结合细胞表面的干扰素受体分子，通过JAK-STAT信号通路激活α-干扰素和众多具有抗病毒活性的ISG的表达。

体外实验表明，HCV在感染过程中能有效地抑制宿主细胞产生干扰素，从而使自己得以生存，这种抑制是由HCV编码的NS3和NS4A组成的丝氨酸蛋白酶来实现的[18]。该蛋白酶能剪切降解Trif和MAVS分子，从而阻断TLR3和RIG样受体-Ⅰ介导的干扰素信号通路的激活[19-20]。该发现有着重要的意义，它意味着目前研发的NS3/NS4A丝氨酸蛋白酶小分子抑制药物不但能阻断HCV病毒蛋白在翻译后的剪切和成熟，还能逆转HCV对宿主干扰素信号通路的抑制，从而激活一系列的抗病毒反应，达到清除病毒的目的。

有意思的是，虽然体外细胞实验毫无争议地证明了HCV能有效抑制宿主干扰素信号通路的激活，但大量的体内实验指出HCV感染的黑猩猩或人的肝脏组织均有明显的ISG的表达，而且感染过程中ISG的上调和HCV在血清中的滴度成正相关关系[21]。这些研究结果说明HCV在自然感染机体的情况下不能或不能有效地抑制宿主干扰素信号通路的激活，或者是这些检测到的ISG的表达是由未感染的肝细胞或肝内的其他细胞，如库普弗细胞和树突状细胞等产生，显然这些重要的问题需要更多的实验来回答。

越来越多的实验结果表明，HCV感染所激活的ISG不但不能帮助机体清除病毒，反而降低了患者对干扰素治疗的应答率。Sarasin-Filipowicz等[22]通过比较干扰素治疗前和治疗6h后肝活体组织中的全基因组表达图谱的变化，发现疗效较好的患者在治疗前的ISG处于基线，干扰素治疗能上调肝内ISG的表达；然而疗效不佳的患者在治疗前大部分肝内ISG已被诱导，外源的干扰素刺激并没有进一步增加这些ISG的表达水平。这项工作有着重要的临床意义，它说明丙型肝炎患者干扰素治疗前ISG的表达水平是一项关键的疗效预测指标。这项工作也留下了大量的亟待解决的科学问题，如在疗效不佳的患者里治疗前诱导产生的ISG为什么不能有效清除HCV？外源干扰素为什么不能进一步增加这些ISG的表达水平？这些问题的解决将对提高干扰素的疗效，开发丙型肝炎治疗的新药物或疗法有着重要的作用。

参  考  文  献

[1]Meuleman P, Leroux-Roels G. The human liver-uPA-SCID mouse: a model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV. Antiviral research, 2008, 80: 231-238.

[2]Blight KJ, Kolykhalov AA, Rice CM. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science, 2000, 290: 1972-1975.

[3]Bartosch B, Dubuisson J, Cosset FL. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. J Exp Med, 2003, 197: 633-642.

[4]Kato T, Date T, Miyamoto M, et al. Efficient replication of the genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon. Gastroenterology, 2003, 125: 1808-1817.

[5]Wakita T, Pietschmann T, Kato T, et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med, 2005, 11: 791-796.

[6]Lindenbach BD, Evans MJ, Syder AJ, et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science, 2005, 309: 623-626.

[7]Zhong J, Gastaminza P, Cheng G, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102: 9294-9299.

[8]Lindenbach BD, Meuleman P, Ploss A, et al. Cell culture-grown hepatitis C virus is infectious in vivo and can be recultured in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103: 3805-3809.

[9]Gottwein JM, Scheel TK, Jensen TB, et al. Development and characterization of hepatitis C virus genotype 1-7 cell culture systems: role of CD81 and scavenger receptor class B type I and effect of antiviral drugs. Hepatology, 2009, 49: 364-377.

[10]Evans MJ, von Hahn T, Tscherne DM, et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature, 2007, 446: 801-805.

[11]Ploss A, Evans MJ, Gaysinskaya VA, et al. Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of mouse cells. Nature, 2009, 457: 882-886.

[12]Coyne CB, Shen L, Turner JR, et al. Coxsackievirus entry across epithelial tight junctions requires occludin and the small GTPases Rab34 and Rab5. Cell Host Microbe, 2007, 2:181-192.

[13]Winter J, Jung S, Keller S, et al. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol, 2009, 11:228-234.

[14]Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, et al. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science, 2005, 309: 1577-1581.

[15]Henke JI, Goergen D, Zheng J, et al. microRNA-122 stimulates translation of hepatitis C virus RNA. EMBO J, 2008, 27: 3300-3310.

[16]Pedersen IM, Cheng G, Wieland S, et al. Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism. Nature 2007, 449, 919-922.

[17]Sarasin-Filipowicz M, Krol J, Markiewicz I,  et al. Decreased levels of microRNA miR-122 in individuals with hepatitis C responding poorly to interferon therapy. Nat Med, 2009, 15: 31-33.

[18]Cheng G, Zhong J, Chisari FV. Inhibition of dsRNA-induced signaling in hepatitis C virus-infected cells by NS3 protease-dependent and -independent mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103: 8499-8504.

[19]Meylan E, Curran J, Hofmann K, et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature, 2005, 437: 1167-1172.

[20]Li K, Foy E, Ferreon JC, et al. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102: 2992-2997.

[21]Su AI, Pezacki JP, Wodicka L, et al. Genomic analysis of the host response to hepatitis C virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99: 15669-15674.

[22]Sarasin-Filipowicz M, Oakeley EJ, Duong FH, et al. Interferon signaling and treatment outcome in chronic hepatitis C. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105: 7034-7039.