【关键词】 肝功能衰竭； 受体，肿瘤坏死因子； 肠黏膜屏障； 紧密连接蛋白； 小鼠
TNF alpha induced elimination of intestinal epithelial tight junction protein occludin via TNFR1 in mice with fulminant hepatic failure CUI Wei, LIU Pei.
【Key words】 Liver failure; Receptors, tumor necrosis factor; Intestinal barrier; Tight junction; Mice
【First author's address】 Department of Digestive Diseases, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China
Corresponding author: LIU Pei, Email: syliupei2003@ yahoo.com.cn
肠黏膜屏障对于抵抗肠道病原微生物的侵入具有重要作用。暴发性肝衰竭（FHF）时肠黏膜屏障的通透性增加[1-4]，细菌及其毒性产物穿透肠壁进入体内，引起自发性腹膜炎甚至败血症。FHF时肠黏膜屏障通透性的增加与肠上皮细胞紧密连接的破坏有关。我们的前期研究发现，在FHF时，肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降，并且这一改变与TNFα有关，本研究进一步研究了TNFα这一作用的受体机制。
一、材料与方法
1. 实验动物及试剂：雄性BALB/c小鼠150只，6～8周龄，质量18～22g，由中国医科大学实验动物中心提供。D-氨基半乳糖（GalN）、内毒素购自美国Sigma公司；重组小鼠TNFα、小鼠TNFα-IgG抗体、小鼠TNFR1-IgG抗体购自美国RD公司；兔抗occludin多克隆抗体购自美国Zymed公司；RNA PCR试剂盒、T7体外转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
2. 动物模型制备：采用GalN/LPS联合腹腔内注射制备暴发性肝衰竭小鼠动物模型[5]。动物随机分为7组，1组：等渗盐水对照组，20只；2组：LPS对照组，20只；3组：GalN对照组，20只；4组：暴发性肝衰竭组（LPS+GalN），50只；5组：TNFα组，20只；6组：TNFα抗体组，20只；7组：TNF受体1（TNFR1）抗体组，20只。各组分别于注射后6、9h随机取10只小鼠，断头处死，取部分大肠组织置于甲醛溶液中固定以制备石蜡标本，部分置于Eppendorf管中-80℃保存以提取蛋白，部分置于Trizol液中-80℃保存以提取RNA。
3. 紧密连接蛋白occludin免疫组织化学染色：采用SABC法，抗原修复采取胃蛋白酶K 37℃孵育30min，正常山羊血清封闭，兔抗小鼠多克隆occludin抗体（1∶50稀释）4℃过夜，生物素标记的羊抗兔-IgG抗体37℃孵育20min，SABC试剂37℃孵育20min，DAB显色，苏木素复染，显微镜下观察。PBS代替第一抗体作空白对照。
4. occludin蛋白Western blot分析：大肠组织置于蛋白质裂解液中，超声波粉碎机粉碎，匀浆置于4℃冰箱过夜，12000×g 4℃离心1h，取上清液即为膜蛋白质。采用BCA法对蛋白质样品进行定量，将蛋白质样品调成相同浓度，加入上样缓冲液，沸水煮5min进行蛋白质变性。取50μg总蛋白质进行8% SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白质转至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭2h，加入多克隆兔抗occludin抗体（1∶1000稀释）4℃过夜；然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔-IgG抗体（1∶2000稀释）室温2h，BCIP/NBT显色液显色。结果以β-actin作为内参照，通过天能图像分析系统进行分析，occludin蛋白含量=样本occludin蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值。
5. 实时定量PCR：用Trizol一步法提取大肠组织RNA。采用SYBR Green I荧光染料嵌合法检测occludin mRNA。先构建目的基因（occludin基因）和看家基因（GAPDH）的RNA标准品，制作标准曲线，用标准曲线对样品中的目的基因和看家基因分别进行定量。通过看家基因的校正，检测各组大肠组织中occludin目的基因的相对表达量。Occludin mRNA的相对表达量=occludin基因拷贝数/同一样本GAPDH基因拷贝数。Occludin的上游引物为5′-GCTTATCTTGGGAGCCTGGACA-3′，下游引物为5′-GTCATTGCTTGGTGCATAATGATTG-3′，扩增片段108bp；GAPDH的上游引物为5′-AAATGGTGAAGGT CGGTGTG-3′，下游引物为5′-TGAAGGGGTCGTTGA TGG-3′，扩增片段144bp。PCR反应体系的组成参照说明书进行，PCR反应条件为95℃ 10s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 20s，45个循环。
6. 统计学分析：应用SPSS10.0软件进行统计学分析。数据以x-±s表示，采用单因素方差分析的Dunnet t检验对各组间数据进行比较。
二、 结果
1. occludin免疫组织化学染色：在第1、2、3组的大肠组织切片中，occludin主要沿肠黏膜上皮细胞膜的顶端分布，呈强表达的棕褐色线状信号，在整张切片上均可见到。但是在肝衰竭组，6h时棕褐色阳性信号即开始减弱，9h时更为明显，且阳性细胞数减少。单独注射TNFα组9h时大部分小鼠（8/10）可以见到occludin阳性染色减少，经过抗 TNFα-IgG抗体或抗TNFR1抗体预先阻断后，大肠组织内阳性反应明显增加见图1。
2. Western blot 分析：各组标本在相对分子质量为6.5×104处均可见特异性的蛋白质条带，对各条带进行灰度分析发现第1、2、3组occludin蛋白的表达差异无统计学意义，第4组6h时occludin蛋白含量开始下降，9h时达到最低值，第5组9h时occludin蛋白含量下降，这两组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。应用TNFα抗体或抗TNFR1抗体进行阻断后，蛋白表达量明显增加，接近正常水平，见图2。
3. 实时定量PCR：第1、2、3组occludin的mRNA水平无差异，第4、5组6h时occludin mRNA达到最低值，与等渗盐水对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），9h时有所恢复。TNFα抗体组及TNFR1抗体组occludin mRNA无明显变化。
三、 讨论
肠道不仅能消化、吸收营养物质，而且对肠道细菌、毒素及多种有害物质具有重要的屏障作用。肠黏膜屏障由肠黏膜上皮细胞及其间的连接复合体组成，其中最重要的是肠黏膜上皮细胞间的紧密连接[3，4]，它环绕在上皮细胞的顶端，将细胞旁的缝隙封闭起来，限制大分子物质的通过。暴发性肝衰竭时肠黏膜屏障的通透性增加[1, 2]，许多正常情况下不能通过的细菌、毒素可以通过，进而入血引起感染等并发症。
TNFα在肠黏膜屏障损伤中发挥重要作用。有研究表明TNFα能增加体外培养的肠黏膜上皮细胞内的吞饮小泡，并能下调紧密连接蛋白occludin启动子的表达[6, 7]。我们的研究结果亦证实了在FHF小鼠中，存在肠黏膜上皮细胞间紧密连接断裂以及紧密连接蛋白occludin表达下降[5]，应用抗TNFα抗体可以阻断这些变化，提示TNFα在暴发性肝衰竭肠黏膜屏障损害过程中发挥了重要作用。
TNFα要发挥作用必须首先与细胞膜上的受体结合，TNFR按分子量大小分为5.5×104（TNFR1, P55）和7.5×104（TNFR2, P75）两种[8]，因为两种受体胞内区结构不同，它们的细胞内信号传导方式及生物学效应也不同。TNFR1被认为是TNFα的主要受体，能诱导细胞凋亡并调节TNFα的多种生物学作用。TNFR2的确切作用还不十分清楚。
本实验中我们应用抗TNFR1抗体来抑制TNFα与TNFR1的结合，从而研究TNFα引起暴发性肝衰竭小鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达下降的受体机制。结果表明9h时，FHF组小鼠及TNFα组小鼠均可见到occludin的阳性染色明显减弱，经过抗TNFR1抗体预先阻断后，阳性反应明显增加。Western blot结果与免疫组织化学结果相一致。实时定量PCR结果进一步证实FHF组小鼠与TNFα组小鼠occludin mRNA表达降低，抗TNFR1-IgG抗体可以阻断这一反应。
参 考 文 献
[1]Harari Y, Weisbrodt NW, Moody FG. Ileal mucosal response to bacterial toxin challenge. J Trauma, 2000,49:306-313.
[2]Kiyono H, Kweon MN, Hiroi T, et al. The mucosal immune system: from specialized immune defense to inflammation and allergy. Acta Odontol Scand, 2001, 59:145-153.
[3]Tsukita S, Furuse M, Itoh M. Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2: 285-293.
[4]Schneeberger EE, Lynch RD. The tight junction: a multifunctional complex. Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 286: C1213-C1228.
[5]Cui W, Ma L, Wen Y, et al. Down-regulated expression of intestinal epithelial tight junction protein occludin in mice with fulminant hepatic failure. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2006, 14: 3008-3012.
崔巍,马力，闻颖，等.暴发性肝衰竭时肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降.世界华人消化杂志,2006，14:3008-3012.
[6]Mankertz J, Tavalali S, Schmitz H, et al. Expression from the human occludin promoter is affected by tumor necrosis factor alpha and interferon gamma. J Cell Sci, 2000, 113 ( Pt 11): 2085-2090.
[7]Hanada S, Harada M, Koga H, et al. Tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma directly impair epithelial barrier function in cultured mouse cholangiocytes. Liver Int, 2003, 23: 3-11.
[8]Ait-Ali D, Turquier V, Grumolato L, et al. The proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 stimulate neuropeptide gene transcription and secretion in adrenochromaffin cells via activation of extracellularly regulated kinase 1/2 and p38 protein kinases, and activator protein-1 transcription factors. Mol Endocrinol, 2004, 18: 1721-1739.
中华肝脏病杂志版权 |
