【关键词】 肝炎病毒，丙型; NS3蛋白；血清饥饿； 细胞凋亡
Effects of HCV NS3 protein on apoptosis of QSG7701 cells induced by serum starvation SUN Shu-yan, GUO Hui, LI Bo, HE Qiong-qiong, FENG De-yun.
【Key words】 Hepatitis C virus; NS3 protein; Serum starvation; Apoptosis
【First author's address】 Department of Pathology, Basic Medical College, Central South University, Changsha 410078, China
Corresponding author: FENG De-yun, Email: dyfeng743@ sohu.com
HCV相关性肝癌的致病机制尚不清楚。人们发现细胞凋亡的抑制有利于逃避机体的免疫监视及细胞毒性治疗引起的细胞死亡，在肿瘤形成过程中起重要作用。凋亡参与HCV相关性疾病的致病机制及其预后。HCV NS3蛋白在病毒生活周期中起重要作用，且可和宿主蛋白相互作用。已有研究表明，HCV NS3蛋白与肝癌的发生密切相关[1，2]。本实验以人永生化肝细胞系QSG7701为载体建立的稳定表达HCV NS3蛋白的肝细胞模型为研究对象，观察HCV NS3蛋白对血清饥饿所诱导的QSG7701细胞凋亡的影响，以探讨HCV NS3蛋白是否通过对细胞凋亡的调控参与HCV相关性肝癌的发生。
一、材料与方法
1. 材料：转染质粒pcDNA3.1-NS3并稳定表达HCV NS3蛋白的QSG7701细胞（QSG7701/NS3）为本实验室保存，水浴复苏后培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。
2. 试剂：抗HCV NS3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，抗caspase3单克隆抗体，抗cleaved caspase3单克隆抗体购自美国Cell Signalling公司，原位末端标记法（TUNEL）试剂盒购自美国RD公司，第二抗体及SP试剂盒购自北京中杉公司。
3. 方法：（1）实验分组：①未转染的QSG7701；②空白质粒pcDNA3.1转染的QSG7701（QSG7701/pcDNA3.1）；③④⑤分别为3株HCV NS3蛋白表达质粒pcDNA3.1/NS3转染的QSG7701（QSG7701/NS3-1，-2，-3）。（2）血清饥饿处理：各组细胞对数生长期时分别用0%，1%，2%血清饥饿48h，72h，96h。（3）Western blot：参照《分子克隆》的实验步骤进行总蛋白质的提取，BCA Protein Assay Reagent定量，取100μg已定量的总蛋白进行15% SDS-PAGE电泳，电转移至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭1h，TBS/T洗膜，3×5min，加入第一抗体，室温下孵育12～16h，TBS/T洗膜，3×5min，加第二抗体，37℃孵育3h，TBS/T洗膜，3 ×5min，DAB显色。利用UTHSCSA Imagetool Analysis software测定Western blot条带净灰度值，并与内参照β-actin测定结果相比较，计算其比值。（4）免疫细胞化学检测：各组细胞用免疫细胞化学SP法检测活化caspase3蛋白的表达及细胞内定位。阳性细胞判断：以细胞质或（和）细胞核出现淡黄至棕黄色颗粒为阳性。（5）TUNEL法检测凋亡：常规细胞传代，接种于铺有无菌盖玻片的6孔培养板内，长至对数生长期用0%血清饥饿72h后，按TUNEL法检测试剂盒要求操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 即凋亡细胞。400倍镜下随机计数10个视野（总数>1000个细胞）中阳性细胞所占的百分比作为细胞凋亡指数（AI）。（6）流式细胞术检测：对数生长期5组细胞用0%血清饥饿72h，分别收集2×106个细胞，70%乙醇4℃固定，碘化丙啶染色，流式细胞仪上进行检测凋亡细胞的百分率，CELLQuest软件进行数据处理。（7）统计分析：采用SPSS13.0软件进行分析。
二、结果
1. HCV NS3蛋白在QSG7701细胞中的表达：Western blot检测结果显示在3株QSG7701/NS3细胞中均检测到HCV NS3蛋白的特异性条带，而未转染的QSG7701细胞和QSG7701/pcDNA3.1细胞中均未见HCV NS3蛋白的表达。
2. 血清饥饿诱导细胞凋亡时活化caspase3表达及活性的变化：5组细胞分别经0%，1%，2%血清饥饿72h，Western blot法检测可见相对分子质量为17×103的caspase3活性亚单位（p17）表达。未转染组（QSG7701）与空白质粒转染组（QSG7701/pcDNA3.1）细胞相对分子质量为17×103的caspase3活性亚单位表达较强，3株HCV NS3蛋白表达质粒转染组细胞（QSG7701/NS3）的条带显色较弱。取一株HCV NS3蛋白表达质粒转染组细胞，在细胞对数生长期时分别用0%、1%、2%血清饥饿48h、72h、96h。处理48h时活性已升高，到达96h活性达高峰，0%血清处理的细胞其活性升高最明显。
3. 活化caspase3在细胞内的表达和定位：0%血清作用72h，活化caspase3表达于细胞质，为棕黄色颗粒（图1）。QSG7701，QSG7701/pcDNA3.1，QSG7701/NS3-1，2，3组平均阳性细胞数分别为41.67%，40.32%，32.28%，34.56%，33.29%。未转染组和空白质粒转染组的平均阳性细胞数高于3株HCV NS3蛋白表达质粒转染组，χ2值分别为14.57，18.95，21.34，15.47，19.56和21.12，P值均<0.05。
4. TUNEL法检测细胞的凋亡：0%血清处理72h，TUNEL法检测结果显示阳性信号位于胞核，凋亡细胞散在分布。QSG7701，QSG7701/pcDNA3.1，QSG7701/NS3-1，2，3组平均凋亡指数分别为41.51%，45.31%，31.60%，24.30%，27.58%。未转染组或空白转染组的细胞凋亡率显著高于3株HCV NS3蛋白表达质粒转染组，χ2值分别为11.24，17.32，15.44，13.38，18.55和16.25，P值均<0.05，而未转染组和空白转染组之间及3株HCV NS3蛋白表达质粒转染组之间差异无统计学意义，χ2值分别为1.24和3.15，P值均>0.05。
5. 流式细胞术定量检测凋亡细胞：0%血清作用72h，QSG7701、QSG7701/pcDNA3.1、QSG7701/NS3-1，2，3组细胞凋亡率分别为31.9%，41.1%，19.3%，22.6%，22.8%，HCV NS3蛋白表达质粒转染组细胞凋亡率显著低于未转染组和空白转染组，χ2值分别为19.54，17.31，16.42，21.11，19.88和18.97，P值均<0.05。
三、讨论
经典的凋亡通路有两条，即死亡受体通路和线粒体通路，最后都激活caspase蛋白激酶家族导致凋亡发生，其中凋亡执行分子caspase3起到核心作用。
本研究结果显示用不同浓度的血清饥饿诱导细胞凋亡，可见caspase3的17×103的活性亚单位表达， HCV NS3蛋白质粒转染组细胞的活性caspase3表达较对照组低，表明HCV NS3蛋白的表达能抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡；而在我们前期实验发现稳定表达的HCV NS3蛋白对QSG7701细胞的凋亡无明显影响，这提示在QSG7701/NS3细胞中，caspase3主要以无活性的形式存在，HCV NS3蛋白对其影响不明显，不足以表现出抑制凋亡的作用，但在血清饥饿后，HCV NS3蛋白的作用被放大，抑制细胞凋亡。有研究表明，转染HCV NS3的DCs和T、B淋巴细胞其功能异常，且NS3蛋白促进细胞凋亡[3，4]，从而降低机体的免疫功能，使病毒逃避免疫监视，促进其复制和繁殖，HCV NS3蛋白的调控细胞凋亡作用可能具有细胞特异性。
0%血清饥饿细胞72h，流式细胞术和TUNEL法显示各组细胞均出现凋亡，但HCV NS3蛋白表达质粒转染组细胞的凋亡率明显低于未转染组和空白质粒转染组，进一步提示HCV NS3蛋白抑制血清饥饿所诱导的QSG7701细胞凋亡，这与Cheng等[5]的研究结果一致。
在对HCV NS3蛋白表达质粒转染组细胞进行不同血清浓度和不同饥饿时间处理，发现caspase3的活性呈时间依赖性和剂量依赖性。在不同浓度血清饥饿时，随着时间的延长，活化caspase3的表达逐渐升高；在同一时间，随着血清浓度的升高，活化caspase3的表达逐渐降低。但是血清饥饿96h各组细胞的活化caspase3表达较作用72h增高不是很明显，可能是在细胞凋亡的早期已有DNA断裂、蛋白转录翻译过程受阻以及线粒体等细胞器功能障碍，使活化caspase3表达下降。在3种不同浓度的血清中，2%血清诱导细胞凋亡能力较低，这可能是由于该浓度的血清使细胞处于亚饥饿状态，诱导凋亡效果不理想。
我们的研究初步表明caspase3参与了血清饥饿诱导QSG7701细胞凋亡的过程，HCV NS3蛋白抑制活化caspase3的表达从而抑制细胞凋亡，提示HCV NS3可能通过抑制细胞凋亡促使肿瘤形成。
参 考 文 献
[1]He QQ, Cheng RX, Sun Y, et al. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 N-terminal protein. Zhonghua Binglixue Zazhi, 2003, 32: 255-259.
何琼琼,程瑞雪,孙意,等.HCV NS3 N端多肽诱导人肝细胞系转化及成瘤实验.中华病理学杂志,2003,32:255-259.
[2]Ouyang XM, Cheng RX, Feng DY, et al. Effect of hepatitis C virus nonstructural protein NS3 on telomerase activity. Zhonghua Binglixue Zazhi, 2001, 30: 443-447.
欧阳小明，程瑞雪，冯德云，等.丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响.中华病理学杂志,2001,30:443-447.
[3]Thoren F, Romero A, Lindh M, et al. A hepatitis C virus-encoded, nonstructural protein (NS3) triggers dysfunction and apoptosis in lymphocytes: role of NADPH oxidase-derived oxygen radicals. J Leukoc Biol, 2004, 76: 1180-1186.
[4]Siavoshian S, Abraham JD, Thumann C, et al. Hepatitis C virus core, NS3, NS5A, NS5B proteins induce apoptosis in mature dendritic cells. J Med Virol, 2005, 75: 402-411.
[5]Cheng PL, Chang MH, Chao CH, et al. Hepatitis C viral proteins interact with Smad3 and differentially regulate TGF-beta/Smad3-mediated transcriptional activation. Oncogene, 2004, 23: 7821-7838.
中华肝脏病杂志版权 |
