【摘要】 目的 研究ABC转运蛋白基因家族的三个主要成员MDR1、MRP1和Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达及意义。 方法 建立大鼠2-乙酰氨基芴/三分之二肝切除模型，两步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝脏卵圆细胞和肝细胞，采用免疫组织化学染色检测大鼠肝脏组织中MDR1、MRP1、Bcrp1转运蛋白的表达；采用荧光定量PCR方法检测MDR1、MRP1和Bcrp1基因mRNA在卵圆细胞和肝细胞中的表达水平。 结果 免疫组织化学染色显示大鼠肝脏组织中MDR1表达位于门静脉区附近，呈放射状分布，Bcrp1表达定位在细胞膜上。大鼠肝脏卵圆细胞MDR1、MRP1和Bcrp1基因mRNA的表达水平分别是肝细胞的9倍、1.5倍和13.8倍。结论 卵圆细胞表达高水平的ABC转运蛋白，后者参与卵圆细胞免受外源性化学物质损伤的自我保护机制。
【关键词】 肝脏； 卵圆细胞； 转运蛋白类
Expressions of ATP binding cassette transporter genes in rat hepatic oval cells ZHANG Feng, CHEN Xiao-ping, JING Kai, ZHANG Wei, LI Gao-peng, DONG Han-hua, ZHANG Wan-guang, HUANG Zhi-yong. Hepatic Surgery Center, Department of Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: CHEN Xiao-ping, Email: chenxp@ medmail.com.cn
【Abstract】 Objective Liver regeneration occurs through hepatocytes after acute liver injury. However, severe liver injury activates bipotential oval cells from canals of Hering which can differentiate into hepatocytes and biliary epithelial cells. Most models of oval cell activation have employed potential carcinogens to inhibit hepatocyte replication in the face of a regenerative stimulus. Oval cells must be able to withstand the toxic milieu of the damaged liver. ATP binding cassette transporters are cytoprotective efflux pumps that may contribute to the protection of these cells. The aim of this study was to determine the ABC transporter expressions in hepatic oval cells. Methods A rat model was established by feeding 2-acetylaminofluorene combined with partial hepatectomy to activate hepatic oval cells. Oval cells were isolated and purified using selective enzymatic digestion and density gradient centrifugation from the heterogeneous hepatic cell population. The expressions of ABC transporter gene, including MDR1, MRP1 and Bcrp1, in isolated hepatic oval cells and hepatocytes were measured by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction and those in rat liver tissues were measured by immunohistochemistry. Results Compared to those in the rat hepatocytes, mRNA expressions of the genes encoding MDR1, MRP1 and Bcrp1 were increased up to 9-, 1.5- and 13.8-folds in hepatic oval cells. Immunohistochemical staining of rat liver slides demonstrated that the expression of MDR1 proteins was found around periportal areas, and Bcrp1 protein was found located on cell membranes. Conclusion Hepatic oval cells express high levels of the ABC transporter gene that may have cytoprotective functions during severe hepatotoxicity.
【Key words】 Liver; Oval cells; Transport proteins
卵圆细胞能双向分化为肝细胞和胆管细胞，还同时表达造血干细胞标记物c-kit、CD34等，被认为是肝脏的干细胞。在严重肝损伤，肝细胞增生受阻的情况下，卵圆细胞活化、增殖，参与肝再生。介于卵圆细胞在肝脏损伤修复中的重要作用，我们推测卵圆细胞可能具备自身免受外源性化学物质和毒性代谢产物损伤的自我保护机制。ABC（ATP binding cassette）转运蛋白超家族通过水解ATP释放能量来实现跨膜分子转运，与细胞自身保护和肿瘤多药耐药有关。本研究旨在探讨ABC转运蛋白超家族的三个主要成员MDR1（ABCB1）、MRP1（ABCC1）和Bcrp1（ABCG2）在卵圆细胞中的表达及其意义。
材料与方法
1．建立大鼠2-乙酰氨基芴/三分之二肝切除（2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy, AAF/PH）模型：6周龄的雄性SD大鼠（120～150g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）管饲2-AAF（15mg/kg）连续4d，第5天行标准的三分之二肝切除术，然后继续管饲同样剂量和强度的2-AAF连续7d，在肝切除术后第10天处死大鼠。
2．改良Seglen两步胶原酶灌注法结合Percoll密度梯度离心提取卵圆细胞: 大鼠麻醉后剪开腹壁，分离肝下下腔静脉和门静脉，分别插管。经门静脉灌注250ml 37℃预热的PBS液（20ml/min），然后离体灌注0.01%的Ⅳ型胶原酶，剪碎肝脏，置于0.06% Ⅳ型胶原酶溶液中，37℃振荡消化30min，100目滤网过滤后置于0.01%链霉蛋白酶溶液中，37℃消化30min。50×g离心5min，取上清液50×g离心10min，DMEM培养液重悬细胞。将Percoll（购自美国Pharmacia公司）配成50%和70%的密度梯度离心液，从离心管底部逐层铺加，细胞悬液置于最上层，4℃ 12 000 r/min离心30min。小心吸取位于50%和70% Percoll之间的卵圆细胞层，用PBS液洗涤细胞后离心即获得卵圆细胞。肝细胞的分离获取参见文献[1]。
3. 免疫组织化学和流式细胞染色：取PH术后第10天的大鼠肝脏组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、4μm连续切片、HE染色。使用的抗体包括：小鼠抗大鼠OV-6单克隆抗体（1∶10，R&D公司）；兔抗大鼠c-kit多克隆抗体（1∶50，DAKO公司）；小鼠抗大鼠CK19单克隆抗体（工作液，丹麦DAKO公司）；兔抗大鼠Bcrp1多克隆抗体（1∶100，美国Santa Cruz公司），兔抗大鼠MDR1多克隆抗体（1∶100，武汉博士德公司）；兔抗大鼠MRP1多克隆抗体（1∶100，武汉博士德公司）。常规脱蜡水化，3％过氧化氢甲醇溶液孵育灭活内源性过氧化物酶，微波热修复抗原，加入第一抗体4℃孵育过夜，以PBS代替第一抗体作为阴性对照，采用EnVisionTM Detection kit（购自丹麦DAKO公司）进行免疫组织化学染色，DAB显色。常规苏木精复染、脱水、透明、封片。Nikon TE2000-U显微镜镜下观察染色结果。
分离的卵圆细胞经丙酮4℃固定20min，PBS洗涤5min×3次，加入小鼠抗大鼠OV-6单克隆抗体（1∶10）4℃孵育过夜，FITC标记羊抗小鼠IgG 37℃作用1h后，上流式细胞仪进行检测。FACS Calibur计数2×104个细胞，利用Cell Quest软件分析。同型对照为异硫氰酸荧光素标记鼠IgG1。计算卵圆细胞中OV-6+细胞的百分比。
4．总RNA的提取及逆转录反应：分离的卵圆细胞和肝细胞分别加入1ml TRIzol Reageant，提取总RNA。采用立陶宛Fermentas公司的RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。
5．荧光定量PCR检测：MDR1、MRP1和Bcrp1基因引物序列见表1（略），内参照选用GAPDH。荧光定量PCR反应采用SYBRGreen PCR Master Mix试剂盒（购自美国ABI公司）进行。25μl反应体系中含有SYBRGreen PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各900nmol/L，cDNA 1.0μl。50℃ 2min活化UNG酶，95℃ 10min，95℃ 解链15s，60℃退火/延伸1min，共40个循环。每个样本设三个复孔。反应在ABI7000型荧光定量PCR仪上进行。利用比较CT法检测卵圆细胞的MDR1、MRP1和Bcrp1基因mRNA的表达情况。以大鼠肝细胞为校正样本，其MDR1、MRP1和Bcrp1 mRNA值设置为1。结果采用PCR仪自带的SDS软件行统计学分析，可信限为95%。
结 果
1．卵圆细胞增殖模型的鉴定：我们采用卵圆细胞表面特征标记物对卵圆细胞增殖模型进行了鉴定。HE染色可见位于门静脉周围的高核质比的卵圆细胞（图1略）。免疫组织化学染色显微镜下观察，门静脉周围区增殖的卵圆细胞表达卵圆细胞表面标志物OV-6、胆管细胞标志物CK19和造血干细胞标志物c-kit。阳性表达呈棕褐或棕黄色，呈簇状分布或者小管状结构。在PH术后第9～11天卵圆细胞达到增殖高峰，形成大量索状小管状结构向肝实质内延伸（图2～4略）。证实我们成功建立了卵圆细胞增殖模型。
2．分离卵圆细胞的鉴定：我们采用两步胶原酶灌注法结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝卵圆细胞。本方法采用特异性的胶原酶消化肝匀浆，EDTA去除细胞悬液中污染的成纤维细胞，链霉蛋白酶可以消化掉成熟的肝细胞，再经过分离介质Percoll密度梯度离心获得高纯度的卵圆细胞。进一步行卵圆细胞特异性抗体OV-6标记流式细胞染色，结果显示OV-6+细胞的比例为85.36%±7.00%，进一步证实所分离的细胞为卵圆细胞（图5略）。
3．ABC转运蛋白的表达: 荧光定量PCR检测结果显示，大鼠肝卵圆细胞MDR1、MRP1和Bcrp1基因mRNA的表达水平分别是肝细胞的9倍、1.5倍和13.8倍，可信度为95%（图6略）。
免疫组织化学染色显微镜下观察显示，MDR1和Bcrp1表达呈棕褐或棕黄颗粒染色，沿着肝门束呈放射状分布，并逐渐深入到肝小叶中（图7, 8略）。Bcrp1表达定位于大鼠肝卵圆细胞膜（图9略）。MRP1的免疫组织化学染色未获得阳性结果。
讨 论
干细胞区别于成熟分化细胞的重要特征在于具有自我更新和无限增殖的能力。理论上干细胞应当具备自我保护的功能，以确保干细胞生存和自我更新功能的维持。例如造血干细胞含有高水平的醛脱氢酶，从而可以抵抗烷化剂环磷酰胺的细胞毒性作用[2]。支气管上皮干细胞由于缺乏药物代谢酶CYP450 2F2，因而可以耐受气道污染物的侵袭[3]。
在严重肝损伤和肝细胞增生受阻的情况下，卵圆细胞活化、增殖，参与到肝再生，提示卵圆细胞在有害环境下具有某种生存和生长的优势。作为细胞自我防护最主要机制之一的ABC转运蛋白应当在其中发挥重要作用。ABC转运蛋白通过水解ATP释放能量来实现逆浓度梯度的跨膜分子转运，从细胞内向细胞外转运外源性化学物质和药物。在肿瘤细胞中，ABC转运蛋白家族成员通过外排抗肿瘤药物，与多药耐药密切相关。MDR1、MRP1和Bcrp1是三个最主要的多药耐药相关蛋白，在小肠、胎盘，以及血脑、血睾屏障中发挥重要的生理作用。在正常肝脏细胞，MDR1、MRP1和MRP3也参与胆汁组分的摄取和分泌过程[4]。
大鼠喂饲AAF并行三分之二肝切除后，肝细胞周期蛋白E表达减少，p53、p21表达增加，导致肝细胞增殖停滞在G1/S限制点。而位于肝脏终末小叶间胆管的卵圆细胞则具有某种逃脱2-AAF阻断细胞周期和抑制细胞增殖的机制，从而启动增殖和分化，参与肝再生。卵圆细胞增生沿着肝门束呈放射状分布并延伸到肝小叶中，逐渐向肝系和胆系分化[5]。在肝切除术后第9～11天增殖达到高峰[6]。我们的免疫组织化学染色也显示MDR1和Bcrp1蛋白表达沿着肝门束呈放射状分布，并延伸到肝小叶中。我们检测到MDR1、MRP1和Bcrp1在卵圆细胞中的高水平表达，提示卵圆细胞能够主动将一些外源性化学物质泵出到细胞膜外，保护卵圆细胞免受细胞毒性药物的损害，与转运蛋白的细胞保护功能一致[7]。
Ros等[8]在对大鼠2-AAF/PH模型中发现卵圆细胞高表达MRP1和MRP3，与我们的结果不一致。不过Ros等[9]在对人严重肝损伤疾病的研究中发现人肝脏前体细胞表达高水平的MDR1、MRP1和MRP3。Shimano等[10]的研究结果也提示卵圆细胞表达高水平的Bcrp1。同样，在对造血干细胞的研究中，Zhou等[11]发现小鼠原始造血干细胞表达高水平的Bcrp1，而在分化和成熟的血细胞中表达很少。目前对ABC转运蛋白在人和大鼠肝脏干细胞中表达谱差别的原因还不清楚。MDR1、MRP1和Bcrp1基因敲除的小鼠拥有正常的干细胞数量，提示这三个基因对于干细胞的生长和维持并非必需，可能与维持干细胞群处于静息状态有关[12]。
Bcrp1是ABC转运蛋白中惟一定位于细胞膜的半转运蛋白，通过形成二聚体发挥作用。目前研究发现Bcrpl在不同组织来源的侧群干细胞（side population，SP）中高表达[13]。SP细胞能向不同类型和胚层的组织细胞分化，代表了更原始的干细胞。Bcrp1作为SP细胞的表型标记，在SP细胞上的专一表达提示其可能成为从不同组织中分选多潜能干细胞的一种新的标志物。由于目前仍然缺乏分离和鉴定肝脏干细胞的特异性分子标记物，Bcrp1可作为分离、纯化、筛选肝脏干细胞的标记物之一。
总之，干细胞具有维持自身遗传稳定性的保护机制，通过表达高水平的ABC转运蛋白将进入细胞的药物和毒物排出细胞外。在肿瘤组织中也存在这种对化疗药物具有抗性的细胞，这种抗性也正是肿瘤干细胞的重要特性之一。深入研究干细胞中ABC转运蛋白的功能可以帮助我们进一步深入了解肿瘤产生耐药的原因。
参 考 文 献
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