【摘要】 目的 体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞（NPMSCs）分化为类肝细胞，对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。 方法 采用体外细胞培养技术，分离培养人胎肝NPMSCs，在1%基质胶作基质，2.5mmol/L氮胞苷预处理10～12h，肝细胞生长因子10μg/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导。用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征，用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型。采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平，过碘酸希夫试验进行糖原染色。 结果 从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好，连续传10代后，每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞。NPMSCs表型为CD166阳性，CD34阴性。在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28d时，形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%，双核细胞比率5%。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中，有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA，未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA，至诱导后期表达下降，而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶-π和肝细胞核因子1α表达逐渐上升。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb，诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb。NPMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物，28d后阳性染色细胞数量增多。 结论 在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。
【关键词】 干细胞； 细胞分化； 类肝细胞
Human fetal liver nonparenchymal mesenchymal stem cells differentiate into functional hepatocyte-like cells in vitro HE Nian-hai, ZHAO Wen-li, WANG Yu-ming. PLA Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Corresponding author: WANG Yu-ming,
【Abstract】 Objectives To induce nonparenchymal mesenchymal stem cells (NPMSCs) differentiating into functional hepatocyte-like cells in vitro, and to identify the molecular biology and functional characteristics of those hepatocyte-like cells. Methods Human NPMSCs were isolated and cultured with cell culture technique. NPMSCs were induced (on 1% Matrigel as a matrix and then submitted to 2.5 mmol/L AZA pretreatment for 10-12 h), by adding HGF 10μg/L + FGF4 10μg/L + HGM into the culture medium. The characteristics of proliferation and growth of human NPMSCs were studied with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). The phenotypes of NPMSCs were identified by flow cytometry, immunohistochemistry and RT-PCR. Albumin (Alb) levels in culture supernatants were determined with ELISA. Staining for glycogen of undifferentiated NPMSCs and NPMSCs derivated hepatocyte-like cells was conducted with periodic acid-Schiff (PAS) test. Results Growth and division of adherent cells obtained from fetal livers were good and the amount of NPMSCs resourced from each fetus could be amplified to 109 cells after 10 serial subcultivations. The phenotype of NPMSCs was CD166 positive and CD34 negative. The shape of NPMSCs plated on Matrigel with FGF4 and HGF changed from long fusiform to polygonal or round on days 21-28. The rate of cell rounding was 40% and the ratio of dikaryocytes was 5%. Immunohistochemical and RT-PCR detection showed that undifferentiated NPMSCs expressed few alpha fetoprotein (AFP) and AFP mRNA, and did not express any of the liver-specific transcription factors or cytoplasmic markers. Many cells in early induction expressed GATA4, AFP and CK18 proteins and their mRNAs, and their expressions were reduced at the late induction, but the expressions of Alb, CK18, GST-and hepatocyte transcription factor HNF1increased gradually. The ratio of Alb and CK18 positive cells was 60%. Undifferentiated NPMSCs did not produce Alb. Alb production by induced NPMSCs increased in a time-dependent manner. Glycogen storage was first seen on day 14, and maximum levels were seen after day 28. Conclusions There are MSCs among nonparenchymal cells of fetal livers. A high ratio of hepatocyte-like cells was obtained under our induction condition. NPMSCs differentiate firstly into hepatocyte precursors, and then differentiate into mature hepatocytes and hepatocyte-like cells with positive hepatocyte markers. The induced NPMSCs have hepatocyte specific functional features.
【Key words】 Stem cells; Cell differentiation; Hepatocyte-like cells
成熟肝细胞是用于细胞移植及生物人工肝的重要细胞来源。肝细胞移植及生物人工肝是治疗严重肝病的有效手段，但受供体来源、肝实质细胞长期培养困难等限制，它们在临床的应用受到极大的限制，因此，由干细胞诱导分化成成熟肝细胞的研究具有广阔的应用前景。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源丰富，取材方便。最近的研究发现，MSCs在特定的外界环境下可横向分化，如骨髓间质干细胞具有向骨、软骨、神经胶质细胞[1]、心肌[2]、骨胳肌[3]、肝细胞[4]、血管内皮细胞和肺基质等组织细胞转化的能力，动员的外周血干细胞移植到患者体内不但可重建造血功能，而且有一部分干细胞分化形成皮肤、肝和其他消化道细胞[5, 6]。干细胞的这种横向分化特性，拓宽了MSCs的应用范围，最初仅将其当成造血专能干细胞应用，后逐步推广到按多能和亚全能干细胞应用。如果能够利用易于获得的MSCs在体外诱导分化为成熟肝细胞，将为肝细胞移植及生物人工肝提供大量的细胞来源。
我们通过分离、培养方法获得人胎肝非实质间充质干细胞（nonparenchymal mesenchymal stem cells，NPMSCs），体外诱导分化NPMSCs为类肝细胞，对类肝细胞进行分子生物学和功能鉴定。
材料与方法
一、材料
经西南医院伦理委员会同意，并由产妇签署知情同意书。选择12例孕期12～20周死胎，孕周为（18.5±4.6）周，胎儿母亲健康，肝功能正常，乙型肝炎表面抗原阴性，低温保存死胎，并保持胎盘、脐带与胎体连接完整，防止细菌污染胎体腹腔。
二、实验方法
1. 人胎肝NPMSCs的的分离、培养及生物学特性鉴定：参照文献[7]分离培养和观察NPMSCs的生长分裂，流式细胞仪检测NPMSCs表型标记CD166、CD34。
2. 诱导方法：按文献[8]优化的方案进行诱导，先予1%基质胶（Matrigel）包被细胞爬片，选择第3～5代增生旺盛、活力良好的NPMSCs，2.5mmol/L氮胞苷和2%胎牛血清预处理10～12h后，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2次，按（10～20）×103个细胞/cm2接种，给予肝细胞生长因子（HGF）10μg/L加成纤维细胞生长因子4 (fibroblast growth factor 4，FGF4) 10μg/L加肝细胞生长培养基诱导，每2d换液1次。倒置荧光显微镜观察细胞形态变化。
3. 免疫组织化学法检测肝细胞标志蛋白在诱导分化细胞中的表达及分布:分别于诱导4、7、14、21、28d收集细胞，并以未诱导NPMSCs和胎肝细胞作为阴性及阳性对照，以免疫组织化学法检测肝细胞早期标志AFP、CK19及转录因子GATA4，成熟肝细胞标志Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase,GST）-π和肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）1α的表达。操作按SABC免疫组织化学法说明书进行。计数阳性细胞比例。比较不同时相细胞中肝细胞标志表达情况。
4. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测诱导不同时相点细胞内肝细胞标志基因的表达:分别收集未诱导的NPMSCs和诱导10、28d的细胞。RNA的提取按美国Roche公司试剂盒（Tripure分离试剂）说明书进行，取上述溶液4μl加入996μl无RNA酶水中，在紫外分光光度计上测定A260和A280的值。A260/A280在1.8以上说明RNA纯度符合要求。吸10μl（0.4g/L）RNA样品在10g/L琼脂糖凝胶上，160V电泳15min，于凝胶成像仪上，拍照。设计如下4对基因引物，(1)AFP基因引物，特异性扩增片段428bp。上游引物：5′-AAATGCGTT TCT CGTTGC-3′，下游引物：5′-CAGCCTCAAGTTG TTCCTCT-3′。（2）Alb基因引物，特异性扩增片段162bp。上游引物:5′-TGCTTGAATGTGCT GATGACAGGG-3′，下游引物：5′-AAGGCAA GTCAGCAGGCATCTCATC-3′。（3）CK18基因引物，特异性扩增片段361bp。上游引物:5′-GAACCACGAAGAGGAAGTAAA-3′，下游引物：5′-CATCTGTAGGGCGTAGCG-3′。（4）磷酸甘油醛脱氢酶看家基因引物，特异性扩增片段520bp。上游引物：5′-GTCAACGGATTTG GTCTGTATT-3′，下游引物：5′-AGTCTTCT GGGTGGCAGTGAT-3′。以提取的RNA为模板进行逆转录和PCR反应。取5μl扩增液加1μl溴酚蓝于20g/L琼脂糖凝胶电泳，并加小分子量标记，电压50V，电泳40min，取下凝胶于紫外线下观察结果，并在凝胶成像仪上电脑拍照。
5. 培养上清液中人Alb水平检测：用Alb标准品、125I-Alb、兔抗Alb抗体和驴抗兔免疫分离剂建立Alb浓度检测标准曲线，分别于细胞诱导分化的0、3、6、13、20、27d换液，换液量均为3ml，培养24h后收集上清液，用放射免疫分析法检测上清液中Alb浓度。同时记录培养细胞数。研究均为复份，每组研究重复2次。检测灵敏度为0.5mg/L。计算每个细胞每小时 Alb分泌量(pg/h)。计算公式：Alb的分泌量=（标本浓度×3×106）/（24×细胞总数）。
6. 采用过碘酸希夫试验进行糖原染色：分别于诱导7、14、21、28d收集诱导细胞爬片，甲醇固定，以未诱导的NPMSCs和胎肝细胞作阴性及阳性对照。载波片用1%过碘酸氧化5min，蒸馏水漂洗3次。然后，用过碘酸希夫试剂处理15min，蒸馏水漂洗5～10min，苏木精染色1min，蒸馏水漂洗。常规脱水、透明，中性树胶封片。红紫色染色的积聚物看作糖原储存，显微摄像。
三、统计学处理
计量资料用x-±s表示，用统计软件SPSS12.0进行均数t检验或u检验。
结 果
1. NPMSCs原代及传代培养及表型特征鉴定：分离获得的贴壁细胞原代培养时细胞生长较缓慢，接种12h后细胞增殖明显活跃，5～7d后细胞相互接触，布满视野(图1A)。传代培养细胞需8～10d相互接触，细胞经传代后逐渐纯化(图1B)，传10代后可达到109个细胞，同时细胞形态逐渐老化。取传代培养第5代的细胞，流式细胞术显示，NPMSCs中CD166表达阳性细胞比例为96%，CD34表达阳性细胞比例为5.26%。
2. 诱导细胞的形态观察：在添加FGF4和HGF的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28d时，形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%，双核细胞比率5%。
3. 诱导细胞中肝细胞标志的表达：诱导细胞中肝细胞标志的表达结果见表1，图2。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。
表1略 4. 诱导细胞肝细胞标志蛋白基因的表达：RT-PCR显示，未诱导的NPMSCs仅可表达微弱的AFP mRNA，诱导早期可见AFP mRNA表达，诱导后期未见扩增，而Alb mRNA、CK18 mRNA早期和后期均可见表达,见图3。
5. 培养上清液中每小时每个种植细胞表达的Alb产量比较：在分化过程的不同时间点检测Alb生成，同期培养的未诱导分化NPMSCs没有分泌Alb；而给予FGF4和HGF处理后，培养0、4、7、14、21、28d,上清液中Alb产量(pg/h)分别为0、0、180±60、660±220、1370±240、1530±230。NPMSCs产生的白蛋白以时间依赖方式增加。
6. 糖原染色：未诱导培养第28天时的NPMSCs仅个别细胞细胞质内可见微弱的紫红色染色；FGF4和HGF诱导的NPMSCs在14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的积聚物，28d后阳性染色细胞数量增多,见图4。
讨 论
根据肝间充质干细胞体积小、质量轻、从本质上属于非实质细胞这一原理，采用两个步骤分离肝间充质干细胞。第一步的目的是将肝实质细胞与肝非实质细胞分开，第二步再将肝间充质干细胞与其他肝非实质细胞分开。在具体操作过程中，本研究首先采用50×g的离心力将肝实质细胞分离出去，然后再采用500×g的离心力将非实质细胞沉淀，将肝非实质细胞悬液叠加到Ficoll分离液上，900×g离心，吸取分离液和上清液间的细胞层，即为肝间充质干细胞层。这种方法与其他分离方法比较，大大简化了操作程序，分离效果也较为满意，所获得的细胞数及细胞活性都比较理想。
NPMSCs具有特征性的表面标志，它不表达血细胞及内皮细胞的抗原。其特点是：不表达CD34（造血干/祖细胞及内皮细胞呈阳性）、Thy-1和c-Kit（造血干细胞阳性）、CD45（白细胞呈阳性）和HLA-DR（抗原递呈细胞及成纤维细胞呈阳性），而只表达CD29、CD44、CD105、CD147、CD166等基质细胞和间充质干细胞的特异性表面标志，尤其是CD105和CD166已作为NPMSCs的特征性标志[9-11]。用流式细胞术分析本研究中分离到的人胎儿NPMSCs传代第五代，绝大部分细胞表达CD166，而仅有少部分细胞表达CD34，符合间充质干细胞特征。
在添加FGF4和HGF的基质胶上诱导培养NPMSCs 21～28d时，通过免疫组织化学方法检测诱导细胞中肝细胞标志的表达发现未诱导培养的NPMSCs中，仅有较少的细胞表达AFP，未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质标志。诱导培养的NPMSCs在4d后表达肝脏特有的转录因子GATA4和较低水平的细胞质蛋白CK19，AFP阳性细胞比例达到最高，同时非常稀少的细胞呈现肝细胞分化中重要的转录因子HNF1α，细胞质蛋白Alb，或者CK18染色阳性。在7d时，大的上皮细胞出现HNF1α染色阳性，同时Alb和CK18染色强度增加。只有非常少的细胞表达AFP。NPMSCs在诱导培养14、21、28d后，大的上皮细胞GATA4、HNF1α、GST-π、CK18和Alb染色阳性，而AFP或者CK19染色阴性。用Western blot分析确认了AFP、CK18和Alb的免疫组织化学结果。RT-PCR确证了肝细胞分化中重要的细胞质蛋白如CK19、CK18 、AFP、Alb。Schwartz等[12]证明新生小鼠、大鼠和人骨髓来源的多潜能成人祖细胞能在体外分化为一种具有肝细胞表型和功能的内胚层细胞。通过免疫荧光显微镜和三标细胞显示，多潜能成人祖细胞在肝细胞分化条件下培养后以时间依赖方式表达原始和成熟肝细胞标志。蛋白表达轮廓是肝细胞特异性的而不是伪造的，因为非肝细胞标志不会与肝细胞抗原同时表达。用Western blot分析确认了免疫组织化学结果。RT-PCR确证了在内胚层分化中重要的转录因子HNF-3β和GATA4；肝细胞分化中重要的转录因子如HNF1α，细胞质蛋白如CK19、CK18、AFP、Alb等。Oh等[13]分离成年大鼠骨髓细胞，在含表皮细胞生长因子的无血清DF（DMEM/F12）培养基中培养，前5d加入剂量达1mg/L的HGF诱导分化，共培养21d后采用RT-PCR可检测到分化后的类肝细胞内AFP、Alb和HGF的受体c-Met的mRNA表达，免疫组织化学染色亦可见到细胞内AFP、Alb、CK8和CK18的表达。Miyazaki等[14]改用优化后的更适于向肝细胞分化的肝细胞生长培养基代替Oh等[13]采用的DF培养基培养Wistar大鼠骨髓细胞，再次诱导出类肝细胞，且分化程度较诱导的肝细胞更成熟，RT-PCR监测到肝细胞分化终末阶段标志色氨酸-2，3-二氧合酶和酪氨酸氨基转移酶的mRNA。Yamazaki等[15]改用5′-氮胞苷刺激小鼠骨髓细胞12h后再置于肝脏非实质细胞的滋养细胞层上培养，并以肝衰竭患者血清、制瘤素M、地塞米松、50μg/L HGF刺激诱导，2周后对细胞进行组织化学染色和RT-PCR均显示类肝细胞集落中可见肝细胞Alb、CK8、CK18和CK19的表达。将流产胎儿体内的骨髓MSCs植入人为诱发病变的实验鼠肝脏内，发现干细胞在实验鼠体内生长为肝细胞，病鼠肝脏恢复正常功能[16]。唐力军等[17]报道用HGF联合FGF4诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化获得成功，通过免疫细胞化学，RT-PCR和Western blot证实骨髓来源的人多能成体祖细胞在一定条件诱导下具有向肝样细胞分化的潜能。Ong等[18]报道了在丸型结构培养基中将人间充质干细胞与bFGF、HGF和制瘤素M培养4周后获得能表达肝细胞基因。Hussain等[19]报道通过Hoechst染色将肝脏次要细胞群与肝非实质细胞分离，用CD45抗体将SP细胞分为CD45+和CD45-细胞。CD45+和CD45-细胞在肝细胞生长培养基中增殖2～3周后，细胞形态与肝细胞一致，有丰富的细胞质颗粒、致密体、双核和胞内脂褐素，肝细胞标志HepPar、CK8和Alb阳性，RT-PCR证实人Alb、CK18、α1-抗胰蛋白酶、人细胞色素P450 CYP2B6阳性，免疫双标染色(CD45和HepPar)和RT-PCR证实CD45-SP来源的类肝细胞HepPar阳性而CD45阴性，CD45+SP来源类肝细胞也获得HepPar阳性但CD45仅呈微量表达，结论是来源于肝非实质的SP细胞不论CD45阳性或是阴性均是人肝细胞的潜在来源。我们的实验结果显示NPMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞，表达肝细胞分化的早期标志GATA4、CK19和AFP，再分化为成熟肝细胞，表达肝细胞的晚期标志HNF1α、CK18和Alb。NPMSCs在诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。
业已证明联用FGF4和HGF可将NPMSCs诱导为具有肝细胞形态和表型的细胞[12-15，17-20]，单有此点不能证明细胞已分化为肝细胞，除非证明获得了肝细胞的功能性特征[21]。因此，需联合进行几种功能试验以鉴定功能性肝细胞。尽管尿素产生是肝细胞活性的特征，但肾小管上皮也能产生尿素，相反，Alb产生是肝细胞存在和代谢活性的特异性试验,且仅有肝细胞能产生和储存糖原，Ong等[18]报道了在丸型结构培养基中将人间充质干细胞与bFGF、HGF和制瘤素M培养4周后具有分泌Alb和尿素、储存糖原和诱导CYP3A4 mRNA水平的类肝细胞，将这些细胞移入肝切除鼠，可以分泌人Alb。我们的功能试验结果证明诱导培养后的NPMSCs产生Alb，含有糖原颗粒，提示从人胎肝来源的NPMSCs体外用氮胞苷预处理后培养于基质胶包被并加用FGF4和HGF的肝细胞生长培养基时不仅表达肝细胞标志[20]，更有与肝细胞代谢活性一致的功能特征。
在我们的培养系统中，NPMSCs被诱导、去分化而变为肝前体细胞，而后再分化肝细胞样细胞，象在克隆过程所见的培养系统诱导染色质重塑并改变细胞命运一样。NPMSCs在体外能被分离、扩增和保持群体倍增数的未分化状态，并被诱导特异分化为肝细胞样细胞，使NPMSCs成为体内基因性或获得性肝病治疗及应用于生物人工肝装置的理想细胞。进一步的研究是探索NPMSCs衍生的肝细胞样细胞治疗肝脏疾病的潜力。
参 考 文 献
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