【摘要】 目的 研究rtA181位点突变慢性乙型肝炎（CHB）患者的用药史、临床特点及个体化治疗效果。 方法 核苷（酸）类似物（NUCs）治疗中病毒学突破并检出rtA181突变的54例CHB及相关肝硬化患者，检测其血清HBV DNA、HBsAg定量及ALT水平，焦磷酸基因测序法定量检测HBV的P基因区10个NUCs相关耐药突变位点。回顾性分析不同用药史患者的病毒变异模式，比较病毒学突破时与基线期、rtA181单个与多个位点突变时的HBV DNA载量，分析发生病毒学突破时，含rtA181T与含rtA181V位点突变患者的血清学指标。前瞻性队列研究分析不同个体化干预措施的疗效。正态分布的计量资料用t检验进行比较，不符合正态分布的数据用Mann-Whitney检验分析，两组间计数资料的比较采用x2检验或Fisher's精确概率法。 结果 54例rtA181突变的患者中，35例（64.8%）为包含rtA181T的突变。既往用药主要为阿德福韦酯和拉米夫定。应用多种NUCs者，多位点突变占57.6%（19/33）；单一NUCs者，多位点突变占28.6%（6/21），x2 = 4.342，P < 0.05。发生病毒学突破时，患者血清HBV DNA载量较初次NUCs抗病毒治疗时低[(5.66 ± 1.01）log10拷贝/ml比（6.75 ± 0.81）log10拷贝/ml，t = -4.210，P＜0.01]，含rtA181T位点突变患者较含rtA181V位点突变患者HBsAg水平高[(3.80 ± 0.45）log10 IU/ml比（3.46 ± 0.60）log10 IU/ml，t = 2.109，P＜0.05]。对患者分别给予加用或换用恩替卡韦和加用替比夫定治疗，随访满24周时，HBV DNA≥6 log10拷贝/ml的患者中，8例加用或换用恩替卡韦，4例加用替比夫定，其发生病毒学应答者分别为8例和3例，HBV DNA阴转者分别为3例和1例；HBV DNA＜6 log10拷贝/ml中，14例加用或换用恩替卡韦，7例加用替比夫定，其发生病毒学应答者分别为14例和5例，HBV DNA阴转者分别为12例和4例。 结论 用药史与rtA181突变模式有一定关系，应用多种NUCs的患者，易出现多位点突变和多重耐药。加或换恩替卡韦干预治疗的疗效好于加用替比夫定方案。
【关键词】肝炎病毒，乙型； 核苷（酸）类似物； 突变； 治疗； 焦磷酸测序 Clinical characteristics and effect of secondary individualized therapy in chronic hepatitis B patients infected with the rtA181 mutation hepatitis B virus JI Fen-zhi, WANG Lei, YANG Bao-hua, ZHAO Jing-jie, LIU Feng, XUE Yan, LI Tao. Department of Infectious Liver Disease, the Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China
Corresponding author: WANG Lei, Email: wlcrb@ sdu.edu.cn
【Abstract】 Objective To investigate chronic hepatitis B (CHB) patients infected with the antiviral-resistant rtA181 mutation hepatitis B virus (HBV) who have been unresponsive to general therapy to determine the effects of individualized therapy. Methods Fifty-four patients with confirmed rtA181 mutation and who experienced virological breakthrough during nucleos(t)ide analogue (NUC) treatment were enrolled in this prospective cohort study. Their serum levels of HBV DNA, hepatitis B surface antigen (HBsAg), and alanine transaminase (ALT) were tested. Each patient was genotyped by pyrosequencing for 10 mutation sites in the HBV P gene that have been previously correlated to NUC efficacy. Each patient's antiviral therapy and response history was analyzed in regard to their particular mutation pattern. The serological index was determined for carriers of the rtA181T/V mutation. The secondary individualized treatment included adding/switching to entecavir (ETV; group A) or adding telbivudine (LdT; group B) upon confirmation of drug resistance. Effect of individualized treatment was analyzed by T test and Mann-Whitney U test for continuous variables with normal or skewed distributions, respectively. Categorical variables were analyzed by the Chi-squared ( x2 ) or Fisher's exact tests. Results The rtA181T mutation was found in 64.8% (35/54) of patients with rtA181 mutation HBV. The most frequent previously administered medications were adefovir dipivoxil (ADV) and lamivudine (LAM). Multi-site rtA181 mutations occurred more frequently in the patients with multi-NUCs history (57.6%) than in those with single NUCs history (28.6%) (x2 = 4.342, P < 0.05). Serum HBV DNA level at virological breakthrough was lower than that at baseline of the first antiviral treatment (5.66 ± 1.01 vs. 6.75 ± 0.81 log10 copies/ml; t = -4.210, P < 0.01). The serum HBsAg level was higher in carriers of the rtA181T mutation than in carriers of the rtA181V mutation (3.80 ± 0.45 vs. 3.46 ± 0.60 log10 IU/ml; t = 2.109, P < 0.05). In patients with serum HBV DNA ≥ 6 log10 copies/ml at viral breakthrough, 100% (8/8) of patients in the secondary treatment group A and 75% (3/4) patients in the secondary treatment group B exhibited virological response at week 24 after intervention. Undetectable HBV DNA was achieved in three patients of group A and one patient of group B. In patients with serum HBV DNA < 6 log10 copies/ml at viral breakthrough, 100% (14/14) of patients in group A and 71.4% (5/7) of patients in group B exhibited viological response at week 24 after intervention. The serum HBV DNA level decreased to undetectable levels in 12 patients of group A and four patients of group B. Conclusion The rtA181 mutation pattern correlates with previous antiviral therapy response. In addition, multi-site rtA181 mutations occur more frequently in patients with a history of multi-NUCs therapy. Adding or switching rtA181 carriers to ETV produces a more robuts virological suppression than adding LdT.
【Key words】Hepatitis B virus; Nucleos (t) ide analogue; Mutation; Therapy; Pyrosequencing
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个世界性的公共卫生问题，核苷（酸）类似物[nucleos(t)ide analogues，NUCs]抑制HBV复制疗效确切、可靠，并且能够逆转肝纤维化，减少或阻止肝硬化或原发性肝癌的发生。然而，耐药突变的发生是NUCs长期抗HBV治疗失败重要因素之一。rtA181 T或V是耐药突变常见的位点之一，也是最近研究的热点和难点。本研究旨在分析出现rtA181 T或V位点突变患者的用药史、临床特征及个体化治疗方案。
资料与方法
1． 病例来源：山东大学第二医院2008年11月至2011年10月门诊及住院慢性乙型肝炎（CHB）及相关肝硬化患者54例，其中男46例，女8例，中位年龄44（22～68）岁，均为NUCs抗病毒治疗中相隔1个月连续2次复查出现病毒学突破者，采用焦磷酸测序法检出HBV发生rtA181位点突变，且其比率 ＞5%。用药史采用回顾性分析，个体化干预采用前瞻性队列研究。
2． 检测仪器与试剂：（1）HBV DNA检测：仪器为美国ABI公司生产的ABi7000实时PCR扩增仪，试剂盒购自北京鑫诺美迪检测技术有限公司，检测下限为500拷贝/ml。（2）血清HBsAg定量检测：采用美国Abbott公司生产的ARCHITCT i2000型HBV血清标记物的定量检测仪及配套试剂盒。（3）血清ALT检测：采用日本日立公司生产的7170A全自动生物化学分析仪及配套试剂。（4）HBV基因耐药检测：采用焦磷酸基因测序法，定量检测HBV的P基因区10个NUCs相关耐药突变位点（rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V/I、rtN236T和rtM250V），定量值以HBV突变株的所占百分率（%）表示。仪器为瑞士Biotage公司生产的PSQ-96MA/PyroMark ID焦磷酸测序仪，检测试剂盒由上海基因科技有限公司提供。实验操作步骤参考文献[1]。
3. 疗效评估指标：参考《慢性乙型肝炎防治指南（2010版）》[2]。病毒学突破：在未更改治疗的情况下，血清HBV DNA水平较获得病毒学应答的最低点上升1 log10值或一度转阴后又转为阳性，可有或无ALT升高。病毒学应答：血清HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线血清HBV DNA下降 ≥2 log10拷贝/ml。无病毒学应答：在依从性良好的情况下，用核苷（酸）类似物治疗24周时，HBV DNA水平下降 ＜2 log10拷贝/ml。
4．统计学方法：采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x ± s）描述，采用t检验进行比较。不符合正态分布的数据以中位数（范围）表示，采用Mann-Whitney检验分析。两组间计数资料的比较采用x2检验或Fisher's精确概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. 变异模式和既往用药史：54例发生rtA181位点突变的患者中，31例（57.5%）为包含rtA181T的单个位点或多位点突变（即检出耐药突变位点数目≥2个），19例（35.2%）为包含rtA181V的单个位点或多位点突变，4例（7.4%）为同时包含rtA181V和T位点突变的混合病毒株。54例患者的用药情况及耐药模式见表1。既往应用多种NUCs的33例患者中，多位点突变者19例（57.6%），而既往单一NUCs治疗的21例患者中，多位点突变者6例（28.6%），差异有统计学意义（x2 = 4.342，P < 0.05），表明用药史与变异模式有一定关系，应用多种NUCs的患者，易出现多位点突变和多重耐药。
2. 病毒学突破时相关指标分析：配对t检验分析结果表明，发生病毒学突破时的HBV DNA载量[(5.66 ± 1.01）log10拷贝/ml]较初次NUCs抗病毒治疗时的基线HBV DNA载量[(6.75 ± 0.81）log10拷贝/ml]低（t = -4.210，P < 0.01）。单个rtA181位点突变患者发生病毒学突破时的HBV DNA载量[(5.56 ± 0.90）log10拷贝/ml]与多位点突变患者[(5.72 ± 1.10）log10拷贝/ml]间的差异无统计学意义（t = -0.520，P > 0.05）。发生病毒学突破时，含rtA181T与含rtA181V位点突变患者的各指标见表2，其中仅HBsAg水平差异有统计学意义[(3.80 ± 0.45）log10 IU/ml比（3.46 ± 0.60）log10 IU/ml，t = 2.109，P＜0.05]。
3. 个体化治疗及病毒学应答：对其中43例患者分为2组，分别给予加用或换用恩替卡韦（ETV）和加用替比夫定（LdT）两种治疗方案进行干预，2组患者的基线相关资料具有可比性，见表3。病毒学突破时，HBV DNA载量 ≥6 log10拷贝/ml的14例患者中，8例加用或换用ETV干预治疗，随访至24周时均出现病毒学应答，其中3例HBV DNA阴转；6例患者加用LdT治疗，4例随访满24周，3例出现病毒学应答，其中1例HBV DNA阴转，无病毒学应答的1例患者（rtA181V突变）在换用ETV治疗12周时HBV DNA阴转。病毒学突破时，HBV DNA载量 ＜6 log10拷贝/ml的29例患者中，19例加用或换用ETV干预治疗，14例随访满24周的患者均出现病毒学应答，其中12例HBV DNA阴转，1例患者治疗12周HBV DNA阴转后换用LAM + ADV联合治疗，HBV DNA维持在3～4 log10拷贝/ml；10例患者加用LdT干预治疗，7例随访满24周的患者中，5例出现病毒学应答，其中4例HBV DNA阴转，1例无病毒学应答患者（rtA181V和T突变混合病毒株）在换用ETV治疗24周时HBV DNA阴转。以上结果表明，HBV发生rtA181耐药突变后，HBV DNA载量＜6 log10拷贝/ml的患者，治疗效果好，且加用或换用ETV干预治疗方案的疗效好于加用LdT方案。另外，有2例患者采用普通干扰素治疗，1例患者换用干扰素治疗24周，无病毒学应答；1例加用干扰素4周时HBV DNA阴转，随访至24周，维持HBV DNA阴性。
讨 论
焦磷酸基因测序法是近年发展起来的一种新型的DNA序列分析技术，与直接测序法的符合率高，具有高灵敏度等优点，且能检出耐药株所占的比率，可用于动态监测HBV种群的变化。rtA181位点的基序位于HBV的聚合酶（P）开放读码框架（open reading frame，ORF）的逆转录酶区域（reverse transcriptase，RT）的B亚区，由于表面抗原ORF内的S基因区与RT区完全重叠，部分RT区突变可影响S区基因功能[3]。
Yeon等[4]在LAM耐药后换用ADV再次耐药的CHB患者中发现了rtA181V、rtN236T和rtAl81T突变，且rtA181位点突变者可引起HBV DNA反弹。Bartholomeusz和Locarnini[5]的体外实验结果表明，单一rtA181V或rtN236T突变可使HBV对ADV敏感性分别下降4.3倍和7倍,而rtA181V + rtN236T联合突变可使药物敏感性下降18倍，从而证明rtA181V/T和rtN236T位点的突变与ADV耐药有关。刘峰等[6]在LAM耐药后换用ADV和ADV初治的CHB患者中，也检测出rtA181V/T和rtN236T位点的突变，并发现rt181位点突变较rt236位点多见。Yatsuji等[7]在慢性HBV感染患者中发现了与LAM耐药有关的新的突变位点rtA181T，且对LAM的敏感性降低了3倍。本研究54例发生rtA181突变的患者中，存在单个位点rtA181T或V突变和rtA181T和V混合病毒株，其中35例（64.8%）为包含rtA181T的突变；部分患者还伴有rtN236T、rtM204、rtL180和rtV173多位点突变。患者的既往用药以先LAM耐药突变或病毒学突破后序贯/联合ADV治疗和单一ADV的患者为多，分别为22例和19例，再次证明了rtA181突变与ADV和LAM有关，并造成HBV病毒学突破。发生病毒学突破时的HBV DNA载量较初次NUCs抗病毒治疗时低，表明rtA181突变株可能较野生病毒株复制能力降低。同时，我们还发现既往应用多种NUCs的患者更易出现多位点突变。因此，应用ADV或LAM的患者发生病毒学突破考虑有耐药突变发生时，经验性加用LAM或ADV应慎重，建议进行HBV耐药突变检测，并根据耐药突变位点指导临床抗病毒治疗。
由于HBV表面抗原ORF内的S基因区与RT区重叠，Warner和Locarnini[3]的体外实验结果证明RT区Al81T突变对应到S区，可引起172位编码色氨酸（W）的密码子突变为终止密码子，即sWl72*突变，使HBsAg丢失大部分C-末端疏水区，抑制HBsAg的分泌，且该突变可引起HBV DNA在肝细胞内积聚和血清HBV DNA载量下降，这将影响临床上仅依据血清HBV DNA水平判定病毒学突破的结果。而本研究对包含rtA181T突变和rtA181V突变临床病例的HBsAg滴度及HBV DNA载量的初步比较，与以上实验结果不符，还需进一步深入研究。
目前，对rtA181突变病毒株的研究主要体现在与应用NUCs抗病毒药物的关系和体外药物敏感实验方面，尚缺乏对rtA181耐药突变后患者干预治疗的临床研究。2009年欧洲肝病学会CHB临床指南中的资料提示，rtA181T/V耐药突变株对ETV和LdT敏感[8]。据此，本研究对rtA181耐药突变患者随机采用了加或换用ETV和加用LdT的两种治疗方案，均取得了一定的疗效，但加用或换用ETV干预治疗方案的疗效好于加用LdT方案，尤其是在病毒学突破时，HBV DNA载量 ＜6 log10拷贝/ml，采用ETV治疗的14例患者，24周时均取得病毒学应答，12例HBV DNA阴转。另外2例在加用LdT治疗24周无病毒学应答的患者，换用ETV后也取得了HBV DNA阴转的疗效；此外，4例单用和联合LdT治疗的LAM经治患者中也发现了rtA181突变。以上结果提示，对rtA181耐药突变患者，应根据患者的具体情况，结合耐药突变位点，尤其是多重耐药突变位点的变化，以决定尽早加用或换用ETV进行挽救治疗，对无用药禁忌的患者也可试用干扰素治疗。
最近，有学者在应用ETV治疗的CHB患者中，检测到了A181位点突变株[9]；但这些患者对ETV仍有治疗反应，并未引起血清HBV DNA的反弹和ALT水平的升高，应引起关注。在2011年的美国肝病学会年会上，韩国学者Cho等[10]报道，应用LAM耐药后换ADV再次出现HBV病毒学突破，且均存在rtA181V/T突变的24例CHB患者，采用ETV联合ADV进行治疗，随着治疗时间的延长，疗效逐渐提高，于治疗12个月时HBV DNA下降3 log10 IU/ml（中位数），完全病毒学应答率（HBV DNA＜60 IU/ml）33.3%，总病毒学应答率（HBV DNA＜2000 IU/ml）95.8%，证实了rtA181突变的CHB患者加用ETV能取得肯定的疗效。结合Villet等[11]体外实验结果（rtA181V/T变异病毒对LAM的敏感性降低2～11倍，对ADV的敏感性降低2～8倍；rtA181V/T + N236T对LAM的敏感性降低35～43倍，对ADV的敏感性降低5倍以上，对ETV仍旧敏感）以及我们初步的干预治疗结果，我们建议对rtA181等耐药突变的CHB及相关肝硬化患者，应根据患者的临床特征、肝功能结果和用药史，结合HBV DNA和HBV耐药突变检测的结果进行个体化治疗，对ADV初治患者出现rtA181突变或伴有rtN236T突变时，可考虑换用ETV；对曾应用LAM耐药后加或换用ADV后出现rtA181突变，尤其是伴有rtM204突变时，应在继续ADV的基础上加用ETV，必要时采用1.0 mg/d的ETV。
参 考 文 献
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（收稿日期：2011-12-17）
（本文编辑：黄晨） 中华医学会肝脏病杂志版权 |
