【摘要】 目的 研究辛伐他汀治疗非酒精性脂肪性肝纤维化的作用机制。 方法 高脂饲料喂养大鼠复制非酒精性脂肪性肝纤维化模型，辛伐他汀灌胃治疗后，病理学染色观察肝组织病理改变，RT-PCR和Western blot法测定肝组织腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）α的mRNA和蛋白质表达水平，同时测定血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、ALT、AST和血清肿瘤坏死因子（TNF）α水平。体外用促进脂肪细胞分化的培养液诱导人肝星状细胞株LX-2获得静止表型，分别用转化生长因子β1（TGFβ1）、辛伐他汀、TGFβ1 +辛伐他汀处理静止型LX-2细胞，RT-PCR和Western blot法检测AMPKα的mRNA及蛋白质表达变化。多组间数据比较用单因素方差分析或析因设计方差分析，两组间数据比较用q检验。 结果 高脂饮食24周成功复制大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型。随造模时间的延长，肝组织炎症、脂肪变和纤维化程度加重，血清TC、TG、ALT、AST和TNFα水平逐渐升高（P值均< 0.01），肝组织AMPKα的mRNA相对表达量及活性逐渐降低（P < 0.01或P < 0.05）。与模型对照组相比，辛伐他汀治疗组TC、TG、ALT、AST和TNF α水平明显下降（P值均 < 0.05），AMPKα mRNA（0.31 ± 0.05比0.24 ± 0.07）和AMPKα活性（0.45 ± 0.07比0.27 ± 0.07）明显升高（q值分别为3.22和6.44，P < 0.01或P < 0.05）；肝星状细胞的AMPKα活性明显增强（静止型为0.93 ± 0.10比0.72 ± 0.09，活化型为0.72 ± 0.10比0.54 ± 0.10，q值分别为7.00和6.00，P值均 < 0.01），α-平滑肌动蛋白的mRNA和蛋白质表达明显减少（分别为0.30 ± 0.02比0.36 ± 0.02和0.30 ± 0.03比0.38 ± 0.02，q值分别为11.245和11.216，P值均< 0.01），I型胶原的mRNA和和蛋白质表达也明显减少（分别为0.30 ± 0.03比0.37 ± 0.03和0.25 ± 0.03比0.33 ± 0.03，q值分别为8.791和11.163，P值均< 0.01）。 结论 辛伐他汀可以通过提高AMPK活性，抑制肝星状细胞活化，延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的发生和发展。
【关键词】肝硬化； 腺苷酸激酶； 辛伐他汀； 星状细胞 Simvastatin inhibits activation of hepatic stellate cells and promotes activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase CAO Wei, YAN Lei, WANG Wei, ZHAO Cai-yan. Department of Infectious Diseases, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051,China
Corresponding author: ZHAO Cai-yan, Email:zhaocy2005@163.com
【Abstract】 Objective To investigate the underlying molecular mechanism of the cholesterol-blocking drug, simvastatin, in treating nonalcoholic fatty liver fibrosis. Method A rat model of nonalcoholic fatty liver fibrosis was established by feeding Wistar rats a fat-rich diet. After treatment with simvastatin (4 mg/kg/day), liver histological specimens were stained with hematoxylin-eosin and Masson's trichrome for microscopic analysis. Expression of adenosine monophosphate-activated protein kinase-alpha (AMPKα) was evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR; for mRNA) and Western blotting (protein). The levels of serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and tumor necrosis factor-alpha (TNFα) were measured by standard biochemical assays. The human hepatic stellate cell line, LX-2 (quiescent or activated), was treated with transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) alone, simvastatin alone, or TGF-β1 + simvastatin. RT-PCR and Western blotting were used to determine changes in AMPKα mRNA and protein expression, respectively. Results In the rat model of nonalcoholic fatty liver fibrosis, the extent of pathological changes in hepatic tissues correlated with severity of disease progression. The levels of serum TC, TG, ALT, AST and TNFα were increased significantly in model rats (vs. healthy controls; all, P < 0.01). AMPKα mRNA expression and activity was significantly decreased in model rats (vs. healthy controls; P < 0.01 and P < 0.05, respectively). Simvastatin, treatment significantly improved all of these parameters in model rats (vs. untreated model rats; all, P < 0.05). In vitro simvastatin treatment of human HSCs significantly increased AMPKα activity (quiescent LX-2: 0.93 ± 0.10 vs. 0.72 ± 0.09, activated LX-2: 0.72 ± 0.10 vs. 0.54 ± 0.10, q = 7.00, 6.00; all, P < 0.01), decreased α-smooth muscle actin expression (mRNA: 0.30 ± 0.02 vs. 0.36 ± 0.02, protein: 0.30 ± 0.03 vs. 0.38 ± 0.02, q= 11.245, 11.216; all, P < 0.01), and decreased collagen ? expression (mRNA: 0.30 ± 0.03 vs. 0.37 ± 0.03, protein: 0.25 ± 0.03 vs. 0.33 ± 0.03, q = 8.791, 11.163; all, P < 0.01). Conclusion Simvastatin may improve nonalcoholic fatty liver fibrosis by inducing AMPK phosphorylation.
【Key words】 Liver cirrhosis; Adenylate kinase; Simvastatin; Stellate cell 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生与脂质过氧化和胰岛素抵抗等因素有关。活化的腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）可以增强胰岛素敏感性，增加脂肪酸氧化，参与NAFLD的发生和发展。非酒精性脂肪性肝纤维化是NAFLD发展的重要阶段，与肝细胞脂肪变性、肝星状细胞（HSC）活化等因素有关。辛伐他汀为羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，是降血脂的代表性药物。本实验通过高脂饲料喂养大鼠建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型及体外培养人肝星状细胞株，比较辛伐他汀治疗前后AMPKα的活性变化，进一步探讨辛伐他汀、AMPK和非酒精性脂肪性肝纤维化之间的关系。
材料与方法
一、试剂和药物
DMEM培养基、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，重组人转化生长因子β1（TGF β1）购自美国Peprotech公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自美国Promega公司，AMPKα2、α平滑肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原和β-肌动蛋白（β-actin）基因扩增引物购自北京赛百盛基因技术有限公司，肿瘤坏死因子（TNF）α酶联免疫吸附试剂盒购自北京中山生物试剂公司，AMPKα2抗体、磷酸化AMPKα2（p-AMPKα2）抗体购自美国CST公司，α-SMA、Ⅰ型胶原、β-actin抗体和电化学发光液购自美国Santa Cruz公司，磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司。辛伐他汀分散片（20 mg/片，纯度99.9%，等渗盐水溶解）购自广州南新制药公司。
二、体内试验
1. 模型的制备：健康雄性Wistar大鼠40只，体质量（140 ± 10）g，购自河北医科大学动物实验中心。标准饲料喂养1周后，将大鼠随机分为正常对照组（10只）和模型组（30只）。正常对照组给予标准饲料喂养，于第1、8、12、16周末隔夜空腹处死大鼠各2只。模型组予以高脂饮食（标准饲料加2％胆固醇、10％猪油和2％玉米油）喂养，于第8、12、16周末隔夜空腹处死模型组大鼠各6只，病理学检查结果显示16周末出现轻度窦周及中央静脉周围纤维化。遂将剩余模型组大鼠随机分为治疗组和模型对照组各6只，治疗组大鼠在继续高脂饲料喂养的基础上以4 mg·kg-1·d-1剂量的辛伐他汀用等渗盐水溶解灌胃，模型对照组大鼠在继续高脂饲料喂养的基础上以等容量的等渗盐水灌胃，24周末处死全部大鼠。留取血清及肝组织标本。
2. 血清学指标检测：用日本Olympus AU2700全自动生物化学分析仪检测血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、ALT和AST。TNFα水平采用双抗体夹心ELISA法测定。
3. 病理学检测：HE染色观察肝组织普通病理变化，Masson染色观察肝组织纤维化的程度。
4. RT-PCR法检测肝组织AMPKα和Ⅰ型胶原的mRNA表达：Trizol一步法提取肝组织总RNA，半定量RT-PCR扩增转录产物，以β-actin为内参照，引物序列及PCR反应条件见表1。将扩增产物电泳、染色后，应用Bio-Profif图像分析系统进行吸光度扫描，以各指标条带与相对应的内参条带的吸光度比值作为该指标mRNA的相对表达量。
5. Western blot法检测Ⅰ型胶原、AMPKα及p-AMPKα的蛋白质表达水平：提取肝组织蛋白，电泳、转膜、封闭后，加第一抗体、第二抗体，化学发光、曝光、显影后，扫描图片，应用Bio-Profif图像分析系统分析条带。
三、体外试验
1. 细胞培养与标本收集：人肝星状细胞株LX-2购自中国科学院细胞库。将处于对数生长期的LX-2细胞接种在6孔板中，每孔5×105个细胞，用含10%胎牛血清和青链霉素的高糖DMEM培养，待细胞长至70%融合时换用促进脂肪细胞分化的培养基（含10%胎牛血清、青链霉素、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、1μmol/L地塞米松和1μmol/L胰岛素的低糖DMEM）培养72 h，基本获得静止型LX-2细胞，用含0.2%胎牛血清的DMEM培养24 h使细胞同步化[1]。对照组加入溶剂，并以TGFβ1作为阳性对照[2]；处理组分别加入辛伐他汀（10μmol/L）和TGFβ1（100 pmol/L）+辛伐他汀（10μmol/L）处理静止型LX-2细胞24 h，收取细胞。
2. RT-PCR和Western blot法分别检测各组LX-2细胞中AMPKα、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质表达及p-AMPKα蛋白的表达，方法同体内试验。
四、统计学方法
用SPSS13.0统计软件分析实验数据。数据以均数±标准差（ x ± s ）表示，多组间数据比较用单因素方差分析或析因设计方差分析，两组间数据比较用q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. 血清学指标的变化：各模型组大鼠血清TC、TG、ALT、AST和TNFα水平均高于正常对照组（P值均< 0.01），且随着造模时间的延长逐渐升高（P值均< 0.01）。治疗组大鼠上述指标较模型对照组略有下降（q值分别为3.47、3.13、2.98、4.58和3.51，P值均< 0.05）。见表2。
2. 肝组织病理学变化：正常对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞大小一致，呈多边形围绕中央静脉呈放射状分布。8周模型组大鼠表现为单纯性肝脂肪变性，随着造模时间的延长，肝细胞脂变逐渐加重，肝小叶内出现灶状坏死，窦周纤维化，至24周时肝组织呈弥漫性脂肪变性，炎性细胞浸润及小叶内坏死灶增多，可见明显的窦周纤维化及中央静脉周围纤维化。辛伐他汀治疗后，大鼠肝组织脂变、炎症、纤维化程度明显改善。见图1，2。
3. 肝组织Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质表达变化：随造模时间延长，模型组肝组织Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质表达量逐渐增加，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组对照组相比，治疗组肝组织Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质表达量均明显下降（q值分别为9.98和41.227，P值均< 0.01）。见表3。
4. 人肝星状细胞株LX-2中α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质表达变化：TGFβ1组α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质相对表达量均较对照组明显增加（mRNA相对表达量比较，q值分别为44.477和30.530，P值均< 0.01；蛋白质相对表达量比较，q值分别为38.517和32.500，P值均< 0.01）。辛伐他汀组α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质相对表达量与对照组的差异无统计学意义（P值均> 0.05）。与TGFβ1组相比，TGFβ1+辛伐他汀干预后，α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白质相对表达量均明显减少（mRNA相对表达量比较，q值分别为11.245和8.791，P值均< 0.01；蛋白质相对表达量比较，q值分别为11.216和11.163，P值均< 0.01）。析因分析结果表明，辛伐他汀和TGFβ1之间具有拮抗作用（mRNA相对表达量比较，F值分别为49.69和41.211，P值均< 0.01；蛋白质相对表达量比较，F值分别为27.946和45.05，P值均< 0.01）。见表4。
5. 肝组织AMPKα的mRNA相对表达量及活性变化：模型组大鼠肝组织AMPKα mRNA的相对表达量随造模时间的延长逐渐减少（P < 0.01），治疗组表达量较模型对照组增加（q = 3.22，P < 0.05），见图3和表5。以p-AMPKα/AMPKα比值代表AMPKα的活性，结果显示，模型组随造模时间的延长，AMPKα活性逐渐降低（P < 0.01或P < 0.05），治疗组较模型对照组活性增强（q = 6.44，P < 0.01），见图4和表5。
6. LX-2细胞株中AMPKα的mRNA相对表达量及活性变化：TGFβ1对照组AMPKα mRNA表达量较对照组减少（q = 5.25，P < 0.01），辛伐他汀组较对照组显著增加（q = 5.77，P < 0.01）；与TGF β1组相比，TGFβ1+辛伐他汀干预后，AMPKα mRNA表达量增加（q = 7.98，P < 0.01），见图5和表6。TGF β1组AMPKα活性较对照组降低（q = 8.37，P < 0.01），辛伐他汀组较对照组显著增高（q= 7.00，P < 0.01）；与TGFβ1组相比，TGFβ1 +辛伐他汀干预后，AMPKα活性明显增高（q = 6.00，P < 0.01），见图6和表6。析因分析结果表明，辛伐他汀和TGFβ1之间无交互作用（F值分别为0.038和0.247，P值均> 0.05）。
讨 论
他汀类药物可以防治非酒精性脂肪性肝纤维化，具有独立于降脂之外的抗炎和抗氧化作用，减轻炎症损伤程度[3-5]。他汀类药物的作用机制与AMPK存在密切联系。Sun等[6]通过体内和体外实验证实他汀类药物可以促使AMPK快速激活。Xenos等[7]发现他汀类药物应用2 d后，人体内皮细胞AMPK的活化水平升高。然而，目前对他汀类药物与AMPK的研究多停留在心血管系统上，二者在肝脏中的联系则鲜见报道。
本实验以高脂饲料喂养大鼠成功复制非酒精性脂肪性肝纤维化的模型，发现随造模时间的延长，肝脏的脂变、炎症和纤维化程度逐渐加重，大鼠肝组织AMPKα mRNA的表达量、AMPKα活性逐渐降低，证实AMPKα活性的降低与非酒精性脂肪性肝纤维化的发生密切相关。辛伐他汀灌胃8周后，与模型对照组大鼠相比，治疗组AMPKα活性增强，肝组织脂变、炎症、纤维化程度明显改善，血清TC、TG和TNFα水平降低，证实辛伐他汀不仅具有降脂作用，还可以延缓炎症反应、肝脏纤维化的进展，其机制可能与AMPK活性有关。
HSC的增生和激活是肝脏纤维化发生的核心环节，而TGFβ1是最常见的促进HSC活化的细胞因子。本实验以TGFβ1组作为阳性对照，处理组分别加入辛伐他汀、TGFβ1+辛伐他汀干预静止型LX-2，结果提示辛伐他汀显著提高静止型和活化型HSC的AMPKα活性。此外，研究结果还显示辛伐他汀能降低模型对照组肝组织中I型胶原的高表达，同时降低由TGFβ1干预静止型LX-2引起的α-SMA和I型胶原的表达，证实辛伐他汀能抑制HSC活化和细胞外基质的产生，抑制纤维化发生。推测辛伐他汀可能通过增加AMPK活性抑制HSC活化，减少α-SMA和细胞外基质如I型胶原的表达，发挥抗纤维化的作用。Rombouts等[8]发现辛伐他汀还可通过降低类脂化合物活性而延缓肝纤维化进程。此外，他汀类药物的肝毒性早有报道，但本实验结果显示治疗组大鼠血清AST和ALT水平低于模型对照组，与Chalasani[9]提出的肝酶升高的患者使用标准剂量他汀类药物不会增加肝毒性这一论断一致。
总之，辛伐他汀不仅可以降低血脂，还可以减缓炎症程度，逆转肝脏继发的纤维化改变，对肝纤维化具有明确的防治作用，其作用途径可能与AMPK活性的增强存在着直接或间接的联系，这为临床中辛伐他汀的应用提供了更为广阔的空间。由于本课题组研究能力和时间有限，去除高脂饮食因素是否使辛伐他汀的作用效果更加明显，以及辛伐他汀改善NAFLD的更多作用途径尚有待于进一步探索。
参 考 文 献
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[9]Chalasani N. Statins and hepatotoxicity: focus on patients with fatty liver. Hepatology, 2005, 41: 690-695.
（收稿日期：2011-06-06）
（本文编辑：黄晨） 中华医学会肝脏病杂志版权 |
