【摘要】 目的 观察姜黄素衍生物对实验性非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的治疗作用。 方法 60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、等渗盐水对照组（等渗盐水组）、姜黄素灌胃组（姜黄素组）、姜黄素衍生物静脉注射组（衍生物组），每组12只。通过高脂饲料结合四氯化碳的复合方式建立大鼠NASH模型。造模后分别给予姜黄衍生物尾静脉注射及姜黄素灌胃治疗（剂量50 mg/kg），等渗盐水作为对照。治疗结束后取血及肝组织，计算肝指数，进行血脂和肝功能指标检测及病理组织学检查。RT-PCR法检测肝组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）、核转录因子-κB（NF-κB）、羟甲戊二单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的mRNA转录水平，Western blot检测TNFα及NF-κB的蛋白质表达水平。多组计量资料比较采用成组设计的方差分析、Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用LSD法、成组设计的Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结果 与等渗盐水组比较，衍生物组大鼠血清ALT、AST和总胆固醇水平明显下降[分别为（69.20±27.58）U/L对比（102.43±47.29）U/L、（158.00±39.15）U/L对比（229.50±105.20）U/L和（2.08±0.30）mmol/L对比（2.58±1.02）mmol/L，P值均＜0.05]；肝组织纤维化程度（S）显著改善（0.67±0.52对比2.50±0.40，P＜0.05）；TNFα、NF-κB及HMG-CoA还原酶的mRNA表达明显下调（P值均＜0.05），TNFα和NF-κB的蛋白质表达也明显下调（P值均＜0.05）。相对于姜黄素组，衍生物组大鼠肝指数及血清ALT、AST明显下降［分别为4.88%±0.62%对比5.16%±0.61%、（69.20±27.58）U/L对比（82.5±33.23）U/L和（158.00±39.15）U/L对比（211.75±106.30）U/L，P值均＜0.05］；肝组织脂肪变（F）及炎症（G）程度明显减轻（分别为1.17±0.41对比2.20±1.10和1.50±0.55对比2.40±0.58，P值均＜0.05）；TNFα、NF-κB和HMG-CoA还原酶的mRNA表达显著下调（P值均＜0.05）。 结论 相对于传统的姜黄素，水溶性姜黄素衍生物明显延缓实验性脂肪肝大鼠的纤维化进程，改善脂质代谢。 【关键词】 姜黄素； 脂肪肝； 衍生物； 非酒精性脂肪性肝炎 The effects of curcumin derivative on experimental steatohepatitis ZENG Chun-hua, ZENG Ping, DENG Yan-hong, SHEN Neng, PENG Ming-li, LIU Qi, REN Hong. The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Institute of Liver Disease, Chongqing 400010, China Corresponding author: PENG Ming-li, Email: minglip55@yahoo.com.cn 【Abstract】 Objective To observe the effects of curcumin derivative on non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Methods 60 SD male rats were randomly divided into 5 groups. The NASH model was induced by high fat diet combined with carbon tetrachloride. These rats were then treated with curcumin and curcumin derivative, saline treating group as control. The serum biochemical parameters and liver histological examinations were observed. The TNFα, NF-κB and HMG-CoA reductase mRNA transcriptions of liver tissue were detected with RT-PCR. The protein expressions of TNFα and NF-κB were detected by western blot. Results Compared with the saline group, A remarkable reduction was observed in serum ALT (U/L), AST (U/L) and TC (mmol/L) in rats treated with curcumin derivatives [(69.20±27.58) vs (102.43±47.29), (158.00±39.15) vs (229.50±105.20) and (2.08±0.30) vs (2.58±1.02), P < 0.05]. The degrees of fibrosis were significantly alleviated; Compared with curcumin group, liver index and serum ALT, AST of curcumin derivative group were also significantly decreased [(4.88±0.62)vs (5.16±0.61); (69.20±27.58) vs (82.5±33.23); (158.00±39.15) vs (211.75±106.30), P < 0.05]; The liver steatosis and inflammation grade were also significantly improved .The gene transcriptions of TNFα, NF-κB and HMG-CoA reductase in curcumin derivative group were significantly lower than those in curcumin and saline group (P < 0.05). Conclusion These results indicate that the water-soluble curcumin derivative displays superior bioavailability to the parent curcumin, which can effectively improve the lipid metabolism and delay the progression of hepatic fibrosis in rats with steatohepatitis. 【Key words】 Curcumin; Fatty liver; Derivative; Nonalcoholic steatohepatitis 非酒精性脂肪性肝炎（NASH）近年来发病率逐年增高，并呈低龄化趋势[1]。多酚类化合物姜黄素是从中药姜黄中提取的天然色素，具有良好的抗炎和抗氧化作用，众多学者认为其能够从多个环节干预NASH的病理进程[2]。但由于姜黄素不溶于水，稳定性差，生物利用度低，故临床治疗受到很大的限制。本研究所用的姜黄素衍生物是一种保留姜黄素母本结构，经改性后易溶于水的化合物。前期研究结果表明该姜黄素衍生物不仅稳定性好，而且在血浆中的血药浓度更高，组织分布主要在肝脏和胰腺，大大提高了其生物利用度[3]。本实验通过高脂饮食结合四氯化碳（CCl4）的复合方式建立大鼠NASH模型，通过检测姜黄素衍生物治疗后肝组织病理学改变、肝功能变化、肿瘤坏死因子α（TNFα）和核转录因子κB（NF-κB）以及羟甲戊二单酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶表达情况，从抗炎及降脂两方面来阐明姜黄素衍生物的作用机制。 材料与方法 一、材料 1．实验动物：清洁级雄性SD大鼠60只，体质量200～250g，由重庆医科大学实验动物中心提供。 2．实验试剂：姜黄素衍生物由唐华东博士惠赠，胆固醇购自北京鼎国生物科技有限公司，CCl4、石蜡油购自重庆川东化工集团有限公司，Tirol购自美国Invitrogen公司，逆转录RNA试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司，NF-κB及TNFα多克隆第一抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体购自英国Abcam公司。蛋白质裂解液、蛋白质浓度测定试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，蛋白质电泳仪、核酸电泳仪购自北京六一仪器厂，RM2235石蜡切片机购自德国莱卡公司。 二、研究方法 1．动物分组、造模及给药方法：所有大鼠饲养于12h光照环境中，随机分为正常组、模型组、等渗盐水对照组（等渗盐水组）、姜黄素灌胃组（姜黄素组）、姜黄素衍生物静脉注射组（衍生物组），每组12只。正常组饲以普通饲料和自来水。其余各组大鼠于四肢内侧皮下注射40% CCl4石蜡油溶液，剂量为3ml/kg，每周2次，首剂加倍；同时给予含79.5%玉米面、20.0%猪油、0.5%胆固醇的高脂饮食。6周后处死正常组及模型组大鼠各3只，行血清及病理学检测，观察脂肪肝模型制作效果。在验证造模成功后，处死正常组和模型组所有大鼠。同时，姜黄素组给予姜黄素灌胃，剂量50mg/kg，2ml/次，1次/d。等渗盐水组和衍生物组分别给予等渗盐水及姜黄素衍生物尾静脉注射，剂量50mg/kg，1次/d；连续治疗2周，治疗时继续高脂饲料喂养。 2．动物取材：末次给药后，禁食12h，不禁水，次日清晨采用乙醚麻醉，心脏取血，常规分离血清，进行肝功能和血脂检测，其余血清于－20℃保存。留取同一部位新鲜肝组织用4%的中性甲醛溶液固定，部分于液氮中保存待检。 3．血清生物化学指标测定：用日立7600全自动生物化学分析仪测定血清ALT、AST、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）含量。 4．肝指数测定：取大鼠肝脏，用等渗盐水洗去血渍，滤纸吸干并称重，计算肝指数：肝指数=肝质量／体质量×100%。 5．组织病理学观察：肝组织按常规方法行HE染色及油红O染色，显微镜下观察肝脏组织学改变情况。肝组织脂变程度（F）按低倍镜下视野内脂肪变肝细胞占全部肝细胞的范围分级（F0～3）：F0，无脂肪变；F1，33%以下肝细胞脂肪变；F2，33%～66%肝细胞脂肪变；F3，66%以上肝细胞脂肪变。NASH的炎症分级和纤维化分期标准参照改良的Brunt标准[4]。NASH炎症程度（G0～3）分级：G0，无炎症；G1，腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死；G2，腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻、中度炎症；G3，腺泡3带广泛气球样肝细胞，腺泡内点，灶状坏死明显，门管区轻、中度炎症伴（或不伴）门管区周围炎症。NASH的纤维化程度（S0～4）分期：S0，无纤维化；S1，少量的细胞周围或窦周纤维化；S2，局灶或广泛的门静脉周围纤维化；S3，局灶或广泛的桥接纤维化；S4，肝硬化。 6． 实时荧光定量聚合酶链反应测定基因的转录水平：取约50mg肝组织，Trizol法提取总RNA，分光光度计定量，1.0%凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。取500ng RNA产物，根据TaKaRa RNA PCR试剂盒（AMV）Ver.3.0说明书逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Premix Ex Taq颍≒erfect Real Time）说明书，在ABI 7300上进行扩增，检测TNFα、NF-κB和HMG-CoA还原酶3种基因的转录水平，3-磷酸甘油醛脱氢酶作为内参照。所用引物均由上海生工生物工程公司合成，TNFα上、下游引物序列分别为5′-CGCTCT TCTGTCTACTGAACTTC-3′和5′-CTGCTTGGT GGTTTGCTACG-3′；NF-κB上、下游引物序列分别为5′-TCTGTTTCCCCTCATCTTTCCC-3′和5′-GTCTTAGTGGTATCTGTGCTTCTC-3′； HMG-CoA还原酶上、下游引物序列分别为5′-GGA CCAACCTTCTACCTCAGC-3′和5′-TTCAGTT CAAGTATGTCAGGATGC-3′；3-磷酸甘油醛脱氢酶上、下游引物序列分别为5′-CATCCATGACA ACTTTGGTATC-3′和5′-CCATCACGCCA CAGTTTC-3′。基因相对表达量以RQ值表示，RQ值的计算采用2－ΔΔCt法[5]，RQ值≤0.5为显著下调，RQ≥2为显著上调。每组选取3个组织，重复3次，RQ值以均数±标准差表示。 7. Western blot测定肝组织内各种蛋白质的表达：每组随机挑选1只大鼠的肝组织，按100mg肝组织加入1ml蛋白质裂解液的比例裂解组织提取组织总蛋白，Bradford法测定浓度后加入等量1×蛋白质上样缓冲液，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏氟乙烯膜。5%脱脂奶粉封闭，分别加入TNFα（1∶600）及NF-κB（1∶1000）多克隆第一抗体及单克隆β肌动蛋白（1∶2000）第一抗体，室温孵育5.0h，含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗膜，相应HRP标记第二抗体（1∶3000）室温孵育1.5h，最后二氨基联苯胺（DAB）显色，数码相机留图。Quantity One-4.6.2（Basic）软件进行条带灰度分析，β-肌动蛋白作为内参照，测定蛋白质的相对表达量。 三、统计学方法 实验所得数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用SAS统计软件对数据进行分析。多组计量资料比较采用成组设计的方差分析、Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用LSD法、成组设计的Wilcoxon秩和检验。检验水准α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。 结 果 1．大鼠一般情况：造模前4周，除正常组体质量持续增长外，多数大鼠体质量有所减轻，4周后恢复至原来的体质量并继续增长。在造模过程中，有4只大鼠死亡，后续治疗无大鼠死亡。实验结束时大鼠体质量均有所增加，实验开始时体质量（214.23±21.68）g，实验结束时为（239.27±33.04）g。 2．肝指数结果分析：造模结束后，所有大鼠的肝指数均超过5%，达到了脂肪肝的诊断要求，模型组肝指数较正常组明显增高，差异有统计学意义（t＝5.11，P<0.01）。与模型组比较，等渗盐水组、姜黄素组及衍生物组大鼠肝指数均有所下降，差异均有统计学意义（t值分别为3.37、2.77和2.46，P值均<0.05），其中衍生物组下降最为明显。等渗盐水组与姜黄素组比较，差异无统计学意义（t＝3.98，P>0.05）。见表1。 3．血清肝功能及血脂指标结果分析：与正常组比较，模型组大鼠的血清ALT、AST和TC水平均明显升高（tD＝-2.28，P<0.05；t＝6.00，P<0.05；tD＝-2.54，P<0.05）。衍生物组、姜黄素组及等渗盐水组大鼠血清ALT、AST和TC水平均低于模型组，其中衍生物组水平最低，与模型组比较，差异有统计学意义（tD＝－2.25，P<0.05；t＝54.00，P<0.05；tD＝－3.28，P<0.01）。衍生物组大鼠的血清ALT和AST水平明显低于姜黄素组，差异有统计学意义（tD＝－2.85，P<0.05；t＝17.00，P<0.05）。姜黄素组与等渗盐水组比较，血清ALT、AST和TC水平无明显下降（tD＝1.76，P>0.05；t＝4.00，P>0.05；tD＝-0.11，P> 0.05）。TG水平在治疗前后无明显变化（F＝1.83，P>0.05）。见表1。 4．肝组织病理学分析：（1）HE染色见正常组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，肝细胞大小均匀，无变性坏死；模型组大鼠肝脏肝小叶失去正常结构，肝板排列紊乱，肝细胞普遍脂肪变性，炎症坏死及出血明显，少数大鼠的肝脏汇管区还可见明显的纤维组织增生；各治疗组大鼠肝组织少量炎症细胞侵润，肝细胞气球样变，但较模型组明显减轻，以衍生物组明显；等渗盐水组还可见汇管区纤维组织增生，纤维间隔形成（图1）。（2）油红O染色可见正常大鼠肝脏背景呈浅蓝色，未见明显脂滴着色；模型组多数细胞着色，脂滴分布密集；各治疗组脂滴均有所减少，以衍生物组明显（图2）。（3）肝组织病理学分析：综合HE及油红O染色的结果，单人单盲读片后进行逐一分级。模型组大鼠肝脏脂肪变程度及炎症程度几乎处于最高级，纤维化程度较轻。与模型组比较，衍生物组大鼠肝脏脂肪变明显减轻（t＝33.50，P<0.05），炎症程度也明显好转（t＝34.00，P<0.01），纤维化程度差异无统计学意义（t＝25.00，P>0.05）。等渗盐水组大鼠肝脏脂肪变程度较模型组明显减轻（Z＝-2.10，P< 0.05），但出现了明显的纤维化或肝硬化（Z＝2.04，P<0.05）。姜黄素组与模型组比较，肝组织脂肪变程度、炎症分级及纤维化程度差异均无统计学意义（t值分别为22.50、15.00和19.50，P值均>0.05）。见表2。 表2 各组大鼠肝组织脂肪变分级、炎症分级和纤维化 分期结果（x-±s） 组别 动物数(只) 脂肪变分级 炎症分级 纤维化分期 正常组 12 0 0 0 模型组 10 3.00±0.00 3.00±0.00 1.00±0.82 等渗盐水组 10 2.00±0.44 2.33±1.15 2.50±0.40 姜黄素组 12 2.20±1.10 2.40±0.58 1.80±0.84 衍生物组 12 1.17±0.41 1.50±0.55 0.67±0.52 5．TNFα、NF-κB及HMG-CoA还原酶的mRNA表达水平：大鼠肝脏组织中TNFα、NF-κB及HMG-CoA还原酶的mRNA转录水平在模型组均有所升高（RQ值均＞1.0），在衍生物组均显著下调（RQ值均＜0.5）；姜黄素组较模型组亦有所下调（RQ值＜1.0），但作用不及衍生物组明显，与衍生物组相比，差异有统计学意义（t值分别为3.25、7.50和4.82，P值均<0.05），见图3。 6． 肝组织中TNFα及NF-κB的蛋白质表达：TNFα及NF-κB的蛋白表达在模型组最高，衍生物组最低。与模型组比较，姜黄素组与衍生物组NF-κB蛋白的表达明显下降（t值分别为2.37和2.39，P值均＜0.05），TNFα蛋白的表达也明显下降（t值分别为2.65和2.58，P值均＜0.05）。TNFα及NF-κB的蛋白在等渗盐水组与模型组间的差异无统计学意义（P值均＞0.05）。见图4和表3。 讨 论 目前，NASH模型应用较多的是高脂饮食或基因敲除鼠，但真正模拟人类代谢综合征及NAFLD的动物模型还需不断完善[6]。本研究采用CCl4和高脂饮食复合法成功制备NASH模型，造模6周致肝功异常、血清TC显著升高、肝脏明显脂肪变性且无纤维化。但持续造模8周会导致肝纤维化，肝功受损加重，大鼠死亡率提高。因此我们选择复合法造模6周后撤退CCl4，继续高脂饮食2周的模型来评价各治疗组的抗脂肪变效果。 目前，NASH的治疗尚无特效药物，其临床治疗药物主要包括：胰岛素增敏剂、调节血脂药、抗氧化剂和熊去氧胆酸等，但收效甚微[7]。众多研究报道姜黄素对实验性NASH具有明确疗效，其作用机制主要是通过调节NF-κB、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、激活蛋白1和信号转导及转录活化因子3等转录因子的活性来发挥作用[8-10]。NF-κB是一种具有转录激活功能的蛋白质，可以调节包括TNFα在内的涉及细胞转化、凋亡和增殖等方面的多种基因的表达。而TNFα则是促进NASH进展的重要炎症介质。我们发现，无论姜黄素还是其衍生物均可以降低AST和ALT水平，且姜黄素衍生物治疗后的大鼠NF-κB和TNFα的表达明显降低。因此可以推测姜黄素衍生物可通过NF-κB-TNFα通路发挥抗炎活性，从而抑制NASH进展。 从脂代谢的角度来看，大量的动物实验结果表明姜黄素能降低实验性高脂血症大鼠、小鼠的TC、TG和游离脂肪酸，尤以降血浆TG的作用更为显著。但本实验结果显示姜黄素及其衍生物对下调TC的作用明显，而目前关于这方面机制的报道较少。故我们从其合成和代谢出发来解释其机制：姜黄素衍生物能降低胆固醇合成过程中的限速酶HMG-CoA还原酶的表达，进而抑制胆固醇的合成。Babu等[11]还发现姜黄素能够提高肝胆固醇分解代谢限速酶胆固醇-7a-脱氢酶的表达，提示其降脂作用可能与胆固醇分解代谢增强有关。由此可见，姜黄素能够影响胆固醇合成及分解代谢过程中的多种酶的表达，进而降低血清胆固醇水平。 总之，姜黄素衍生物治疗NASH的疗效明显优于传统的姜黄素粉末，提高了姜黄素的生物利用度，且无明显的不良反应，但尚需大量动物模型研究进一步证实，为临床用药提供依据。 参 考 文 献 [1]Fan JG. 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