【摘要】 目的 探讨人stathmin基因在肝癌发生、发展过程中的作用及其机制。 方法 化学合成stathmin序列特异性小干扰RNA，用脂质体LipofectamineTM2000转染人肝癌细胞株HCCLM3细胞。采用RT-PCR和Western blot技术检测stathmin的RNA干扰效率；用细胞计数试剂检测干扰细胞的生长增殖情况；用膜联蛋白V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测细胞凋亡；并用荧光定量PCR检测肿瘤增殖凋亡的相关基因。均数两两比较用配对t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。 结果 RNA干扰HCCLM3细胞后，stathmin的表达被显著抑制（ P＜0.05），抑制率达90%；在RNA干扰24、48 h和72 h时，HCCLM3细胞的增殖抑制率分别为13.04％±0.10％、28.10％±0.41％和37.36％±2.15％（ F = 4.21，P＜0.05）；RNA干扰后，细胞凋亡比例从9.20 %±0.64 %上升至25.11％±1.62%（F = 44.67, P＜0.01）；且RNA干扰组细胞癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平明显下降，促凋亡基因caspase-3、bax和p53的mRNA表达水平升高（ P值均＜0.05）。 结论 stathmin可能通过调节肿瘤增殖相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，参与肝癌的发生和发展进程。 【关键词】 癌，肝细胞； 原癌基因蛋白质类； RNA干扰 The effects of stathmin on cell proliferation and tumor-related genes expressions in HCCLM3 cells GAN Lin*, LI Juan, GUO Kun, LI Yan, SHU Hong, WANG Li, SONG Jie, LIU Yin-kun. *Research Center of Basic Medicine, Luzhou Medical College, Sichuan Province 646000, China Corresponding author: LIU Yin-kun, Email: liu.yinkun@zs-hospital.sh.cn, Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 【Abstract】 Objective To explore the biological function and possible underlying mechanism of stathmin gene during hepatocarcinogenesis. Method Three pairs of chemically synthesized small interfering RNA (siRNA) targeting on stathmin were transfected into HCCLM3 by LipofectamineTM 2000. After confirming the interfering effects of stathmin siRNAs through reverse transcription PCR and Western blotting, the HCCLM3 cells proliferation and apoptosis were detected by cell count kit-8 (CCK-8) and flow cytometry analysis, and the expressions of tumor-related genes (c-myc, c-fos, p53, etc) were observed by real-time PCR. Results Stathmin expression was effectively inhibited up to 90% by stathmin silencing in HCCLM3 cells ( P < 0.05) . By using CCK8 assay, it was shown that HCCLM3 cells proliferation were obviously depressed by 13.04% ± 0.10%, 28.10% ± 0.41% and 37.36% ± 2.15% at the time point of 24 h, 48 h and 72 h with the comparison to Mock group ( F = 4.21, P < 0.05) . The results of flow cytometry demonstrated that the percentage of apoptotic cells was increased to 25.11% ± 1.62% in RNAi group, compared with 9.20 % ± 0.64 % in Mock group ( F = 44.67, P < 0.01). The results of real-time PCR showed that oncogenes c-myc and c-fos expressions were repressed, proliferation-associated gene ki-67 was down-regulated, and apoptosis-promoting gene caspase-3, bax and p53 were induced ( P < 0.05) . Conclusions Stathmin may promote cell proliferation, inhibit cell apoptosis and induce malignant transformation of hepatocytes by regulating some tumor-related genes expressions. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Proto-oncogene proteins; RNA interference Stathmin是重要的微管解离蛋白，广泛分布于细胞胞质，在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤、肝癌等肿瘤中高表达[1-4]。本研究采用RNA干扰技术，观察stathmin表达抑制对肝癌细胞株HCCLM3细胞增殖、凋亡及其一些重要肿瘤相关基因表达的影响，以探讨stathmin在肝癌形成过程中的作用及其机制。 材料与方法 1. 材料：不同转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6为复旦大学肝癌研究所建株并保存；Hep3B细胞由康奈尔大学友情馈赠。DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；Trizol和LipofectamineTM2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自加拿大富酶泰斯公司；半定量PCR和荧光定量PCR试剂盒购自北京天根公司；细胞裂解液和BCA法蛋白质浓度检测试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国Millpore公司；增强化学发光试剂购自美国Pierce公司；人stathmin单克隆抗体购自英国ABCam公司；小鼠抗人3 -磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体购自上海康城公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠第二抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂购自日本同仁化学研究所；异硫氰酸荧光素-膜连蛋白Ⅴ/碘化丙啶(FITC-Annexin V/PI) 凋亡试剂盒购自美国BD公司。 2. 小干扰（small interfering，si）RNA序列的设计：针对人类stathmin基因不同序列的核苷酸为靶点，stathmin siRNA和阴性对照双链小RNA由上海吉凯基因公司合成。stathmin siRNA-1 正义链：5′-GAAACGAGAGCACGAGAAAtt-3′（小写 碱基为保护序列，下同），反义链：5′-UUUCUCG UGCUCUCGUUUCtt-3′，以人stathmin cDNA序列中第221～241位核苷酸为靶点；stathmin siRNA-2 正义链：5′-GCACGAGAAAGAAGUGCU Utt-3′，反义链：5′-AAGCACUUCUUUCUCGUG Ctt-3′，以人stathmin cDNA序列中第230～250位核苷酸为靶点；stathmin siRNA-3 正义链：5′-G AGAACCGAGAGGCACAAAtt-3′，反义链：5′-UU UGUGCCUCUCGGUUCUCtt-3′，以人stathmin cDNA序列中第327～347位核苷酸为靶点；阴性对 照双链小RNA 正义链：5′-UUCUCCGAACGUGU CACGUtt-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUCGG AGAAtt-3′，为与人stathmin cDNA序列中不匹配的21个核苷酸。 3. 细胞培养及转染：人肝癌细胞HCCLM3等在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养；消化计数后按3×105个/孔接种于6孔板；至细胞融合率达60%，按lipofectamineTM 2000试剂说明书进行转染。设转染stathmin siRNA的实验组（RNA干扰组）、转染非编码序列双链小RNA的阴性对照组、未转染的空白对照组。 4.干扰效果的鉴定：(1) RT-PCR检测：分别提取未处理的5种细胞与转染24、48 h和72 h后的HCCLM3细胞总RNA，按照Trizol说明书进行操作；测定总RNA浓度后取2μg行逆转录。后行PCR扩增目的基因和内参照GAPDH。引物序列如下：stathmin 基因：正义链为5′-ATGAGGCAAACCCTGTGAAC-3′，反义链为5′-AGCTTGGCACAGATCCTTGT-3′（158 bp）； GAPDH 正义链为5′-ATGACCCCTTCA TTGACC-3′，反义链为5′-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3′（131 bp）。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。10 g/L琼脂糖电泳观察结果，用VDS成像系统（购自美国Pharmacia公司）扫描分析图像。(2) Western blot检测：分别收集未处理的5种细胞与转染24、48 h和72 h后的HCCLM3细胞，加入细胞裂解液，于4 ℃、12000 r/min离心30 min，提取各组细胞总蛋白质，用BCA法定量。按总蛋白质量30μg/孔上样，行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳，按10 V恒压电转移至PVDF膜；加入stathmin抗体（1∶10 000）和GAPDH（1∶5000），4℃孵育过夜；加入第二抗体（1∶5000），室温孵育1 h；发光、显影、观察结果。用Amercham ImageScanner摄片后，用BioRad The Discovery Series QuantityOne 软件分析。 5.细胞增殖实验：将4.5×103个/孔HCCLM3细胞传代于无菌96孔培养板中。须单独设置空白孔（仅有培养液）和阴性对照孔、空白对照孔和实验孔。于次日用LipofectamineTM 2000进行转染，每组设5个平行孔。细胞转染后培养24、48 h和72 h后，每孔加入CCK8溶液10μl；37℃温育1 h。用酶标仪读取各孔在波长为450 nm的吸光度（ A）值，参比波长450 nm。按公式“抑制率＝[( A阴性对照组-A空白组)－( A实验组－A空白组)]/( A阴性对照组－A空白组) ×100%”计算细胞生长抑制率。 6. 细胞凋亡（Annexin V/PI）的流式细胞术检测：HCCLM3细胞按每孔4.5×105个接种于6孔培养板中，转染48 h后消化、收集细胞，2000 r/min离心5 min，弃去上清液收集细胞。磷酸盐缓冲液漂洗细胞沉淀2次。用凋亡试剂盒中的结合缓冲液20μl重悬细胞沉淀，然后加入AnnexinV和PI工作液各5μl，室温避光染色15 min。流式细胞仪检测。 7. 荧光定量PCR： 用80 nmol/L stathmin siRNA-1转染HCCLM3细胞，48 h后提取细胞总RNA并进行逆转录，用荧光定量PCR法检测几种肿瘤增殖相关基因的表达。引物如下：c-myc基因：正义链为5′-CTCCTCACAGCCCACT-3′，反义链与为5′-ACTGTCCAACTTGACCC-3′（119 bp）；c-fos 基因：正义链为5′-CTGGTGGGAGCTTGCAT CAC -3′，反义链为5′-ACAGCCTGCAGCTTTG TTTC -3′（150 bp）；ki-67基因：正义链为5′-AG AGCTTCACAGCCAGACCTAG-3′，反义链为5′-T GATGGCGTTTGTTTCCTAAAT-3′(120 bp）；caspase-3基因：正义链为5′-ACTGGAATGACATC TCGGTCTG-3′，反义链为5′CATCAATTCCACA ATTTCT TCACGT-3′(126 bp）；bax基因：正义链为5′-AGAGGATGATTGCCGCCGT-3′，反 义链为5′-CAACCACCCTGGTCTTGGATC-3′（243 bp）； p53基因：正义链为5′-TCAACAAGAT GTTTTGCCAACTG-3′，反义链为5′-ATGTGCT GTGACTGCTTGTAGATG-3′(118 bp）。实时定量 PCR按Quant SYBR Green PCR试剂盒说明书操作，每个样品待测基因和GAPDH基因各做3个平行管，用iQTM 5 Multicolor荧光定量基因扩增仪（购自美国Bio-Rad公司）进行扩增。PCR条件：94 ℃ 60 s；94 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共45个循环。 8.统计学方法： 数据用均数±标准差（x ± s）表示，用SPSS13.0软件进行统计学分析，均数两两比较用配对t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 不同人肝癌细胞株中stathmin的表达：选择常见的几种肝癌细胞株（Hep3B、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6），用RT-PCR 和Western blot技术检测stathmin的表达。RT-PCR结果显示stathmin mRNA在Hep3B、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6细胞中的相对表达量依次为0.24±0.06、0.31±0.06、0.44±0.11、0.48±0.08和0.51±0.12。即stathmin在HCCLM3和HCCLM6细胞中表达最高（图1A）。Western blot检测结果与RT-PCR一致，stathmin在HCCLM3和HCCLM6细胞中表达量最高，在Hep3B细胞中表达量最低（图1B）。 2. Stathmin siRNA对HCCLM3肝癌细胞stathmin表达的影响：选择stathmin高表达的肝癌细胞株HCCLM3细胞，进行stathmin RNA干扰研究。设置三个平行实验组：空白对照组（HCCLM3细胞）、阴性对照组（转染非特异性stathmin siRNA，不针对任何基因，经验证转染后不抑制基因表达）和实验组（转染stathmin特异性siRNA）。干扰后用RT-PCR和Western blot检测stathmin mRNA和蛋白质的表达水平，筛选能高度抑制stathmin表达的小干扰RNA序列，并对干扰条件进行优化。半定量RT-PCR和Western blot实验结果显示，用40 nmol/L stathmin siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3分别干扰HCCLM3细胞后，stathmin RNA的相对表达量为：0.15±0.04、0.46±0.10和0.43±0.05；stathmin蛋白相对表达量为：0.31±0.02、0.46±0.01和0.48±0.05，提示stathmin siRNA-1干扰效果最佳（ F值分别为43.12和126.91， P值均< 0.05）。选用stathmin siRNA-1继续优化干扰浓度和时间点，在不同浓度的siRNA-1（10、20、40、80 nmol/L）和不同作用时间（24、48、72 h）条件下分别检测对stathmin的干扰效率，结果显示stathmin siRNA-1在80 nmol/L 、转染48 h的干扰效率最高（图2），其抑制率能达到90％（ F = 19.85, P < 0.01）。 注：A：RT-PCR分析stathmin的基因表达水平；B：Western blot检测stathmin的蛋白表达水平；1：空白对照组；2：阴性对照组；3～5：分别为stathmin小干扰RNA序列-1、-2、-3；6～9：为小干扰RNA-1不同浓度，分别为10 、20、40、80 nmol/L；10～12：分别为小干扰RNA-1作用24、48、72 h 图2 HCCLM3细胞中stathmin 小干扰RNA的干扰效率检测 3. Stathmin RNA干扰抑制HCCLM3细胞增殖：CCK8检测HCCLM3细胞增殖情况，显示转染stathmin siRNA后HCCLM3细胞的增殖受到明显抑制。在作用时间为24、48、72 h时，细胞增殖抑制率分别为13.04％±0.10％、28.10％±0.41％和37.36％±2.15％（ F = 4.21， P＜0.05），随时间延长，抑制率增加。 4. Stathmin RNA干扰可诱导细胞凋亡：Annexin V/PI联合检测stathmin RNA干扰后HCCLM3细胞的凋亡情况，流式细胞仪分析结果见图3。与空白和阴性对照组相比较，RNA干扰组HCCLM3细胞的凋亡比例明显增加，从干扰前的9.20%±0.64 %明显上升至干扰后的25.11%±1.62%（ F = 44.67, P＜0.01）；阴性对照组和空白对照组的细胞凋亡率差异无统计学意义（ P＞0.05）。 5. Stathmin干扰对HCCLM3细胞中肿瘤相关基因表达水平的影响：采用荧光定量 PCR测定stathmin RNA干扰后空白对照组、阴性对照组和实验组中caspase3、bax、p53、c-myc、c-fos和ki-67的CT值，参照文献[5]报道的比较阈值法进行计算：首先按公式“ΔCT=CT平均值(所测基因) -CT平均值(GAPDH)”分别计算各组的ΔCT，用2-?CT代表测定基因mRNA的表达量，按公式“抑制率＝(1-2-??CT)×100% （ΔΔCT＝ΔCT实验组 -ΔCT空白对照组）”计算所测基因的表达抑制率。以对照组细胞CT值的相对表达强度为1，计算阴性对照组和实验组与空白对照组表达量的相对倍数，并以此为纵坐标绘制图4。分析空白对照、阴性对照和实验组中肿瘤相关基因的表达水平，发现在不同组别，caspase -3、bax、p53、c-myc、c-fos和ki-67等基因表达水平差异有统计学意义（ F值分别为73.84，100.01，88.27，117.91，67.50和37.99，P值均 ＜ 0.01）。RNA干扰组促凋亡基因caspase-3、bax和p53的mRNA表达水平上调，表达量分别为阴性对照组的249.8%±2.5%、300.3%±1.5%和290.4%±2.6%，差异有统计学意义（t值分别为-2.07，-1.03和-2.55， P值均＜0.01）；而癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平下降，表达量分别为阴性对照组的64.5%±1.5%、50.8%±1.0%和55.8%±1.8%，差异有统计学意义（ t值分别为17.52，9.67和21.45， P值均＜0.05）。这些基因的mRNA表达水平在阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义( P > 0.05)。 讨 论 人stathmin又称为原癌基因蛋白18，位于染色体1p36.11，相对分子质量为1.9×104。stathmin基因的染色体定位与3个肿瘤特异性染色体区域相关，其中就包括与肝癌相关的1p36.11区域，在此区域染色体等位基因易发生突变、缺失而导致肝癌发生。其基本功能是结合微管蛋白tubulin，作为微管解离蛋白参与微管和纺锤体的组装和活性调节，参与细胞的运动和形态变化[6-8]。 RNA干扰技术是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制，是基因转录后沉默作用的重要机制之一，也是目前研究基因功能的一种关键技术[9]。本研究针对不同靶序列设计不同的siRNA可致相差很大的干扰效果，并进一步筛选时间和浓度以优化RNA干扰条件，并用RT-PCR和Western blot技术鉴定其结果。结果显示stathmin siRNA-1在浓度为80 nmol/L作用48 h时干扰效率最佳，能达到90％；凋亡和细胞增殖实验显示HCCLM3中stathmin的表达抑制可抑制HCCLM3的细胞增殖、促进凋亡，这提示stathmin可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡在肝癌形成过程中发挥作用。 Rubin和Atweh[8]报道stathmin在细胞周期中发挥重要作用，能促进细胞增殖。也有研究表明stathmin可通过p34cdc2、STAT-3等蛋白相互作用，参与调节信号通路、细胞分裂、细胞增殖等过程[10]。本研究结果显示，stathmin表达缺失后，细胞周期被阻滞在G2/M期，尽管这种阻滞并不是非常明显，但符合stathmin在细胞周期通过微管的动态变化参与细胞分裂分化的过程。Baldassarre等[11]也在肉瘤细胞和组织中发现stathmin可以通过与p27(Kip1)的相互作用发挥促进细胞增殖，参与肉瘤的发生和发展过程。Yuan等[12]报道肝癌中stathmin可高表达，且stathmin的高表达可能和p53的突变和骨桥蛋白的高表达相关；Singer等[13]发现p53的缺失和过表达可调节stathmin的表达，从而影响肝癌的发生。这些研究结果还提示stathmin可以通过与p53的相互作用参与肝癌的发生过程。体内外实验提示，在白血病、肉瘤、前列腺癌等肿瘤中通过用反义寡核苷酸可使stathmin表达下调，都不同程度地影响肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖，降低了肿瘤细胞的运动[14]。靶点特异性的抗stathmin效应剂如核酶和siRNA都能在mRNA水平上抑制其表达，增加G2/M期细胞数量，抑制集落生成，明显促进凋亡。这些靶点特异性的抗stathmin效应剂已单独或者与化疗药物联合使用，用于前列腺等肿瘤的治疗[15-16]。这些研究结果更证明了stathmin能通过细胞周期参与细胞凋亡和细胞增殖的调控。 本研究结果还显示，stathmin表达被抑制后，HCCLM3肝癌细胞的癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平下降；而促凋亡基因caspase-3、bax和p53表达上调，提示stathmin可能通过影响这些基因的表达来参与调控细胞增殖和凋亡，参与肝细胞的恶性转化。 总之，本研究结果提示stathmin表达上调在肝癌发生、发展过程中发挥重要作用，为进一步探讨其作用分子机制提供了理论基础。但是，stathmin是否能作为一个新的肝癌诊断、治疗和预后转归的分子标志物还有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]Mistry SJ, Atweh GF. Therapeutic interactions between stathmin inhibition and chemotherapeutic agents in prostate cancer. Mol Cancer Ther, 2006, 5: 3248 -3257. [2]Trovik J, Wik E, Stefansson IM, et al. Stathmin overexpression identifies high-risk patients and lymph node metastasis in endometrial cancer. Clin Cancer Res, 2011, 17: 3368 -3377. [3]Alli E, Yang JM, Hait WN. Silencing of stathmin induces tumor-suppressor function in breast cancer cell lines harboring mutant p53. Oncogene, 2007, 26: 1003-1012. [4]Balachandran R, Welsh MJ, Day BW. Altered levels and regulation of stathmin in paclitaxel-resistant ovarian cancer cells. Oncogene, 2003, 22: 8924 -8930. [5]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, 25: 402-408. [6]Barbier P, Dorléans A, Devred F, et al. Stathmin and interfacial microtubule inhibitors recognize a naturally curved conformation of tubulin dimers. J Biol Chem, 2010, 285: 31672-31681. [7]Budhachandra Kh, Brojen Singh RK, Menon GI. Microtubule dynamics regulated by stathmin. Comput Biol Chem, 2008, 32:141-144. [8]Rubin CI, Atweh GF. The role of stathmin in the regulation of the cell cycle. J Cell Biochem, 2004, 93: 242-250. [9]Naqvi AR, Islam MN, Choudhury NR, et al. The fascinating world of RNA interference. Int J Biol Sci, 2009, 5: 97-117. [10]Verma NK, Dourlat J, Davies AM, et al. STAT3-stathmin interactions control microtubule dynamics in migrating T-cells. J Biol Chem, 2009, 284: 12349 -12362. [11]Baldassarre G, Belletti B, Nicoloso MS, et al. p27(Kip1)-stathmin interaction influences sarcoma cell migration and invasion. Cancer Cell, 2005, 7: 51-63. [12]Yuan RH, Jeng YM, Chen HL, et al. Stathmin overexpression cooperates with p53 mutation and osteopontin overexpression, and is associated with tumour progression, early recurrence, and poor prognosis in hepatocellular carcinoma. J Pathol, 2006, 209: 549-558. [13]Singer S, Ehemann V, Brauckhoff A, et al. Protumorigenic overexpression of stathmin/Op18 by gain-of-function mutation in p53 in human hepatocarcinogenesis. Hepatology, 2007, 46: 759-768. [14]Belletti B, Nicoloso MS, Schiappacassi M, et al. Stathmin activity influences sarcoma cell shape, motility, and metastatic potential. Mol Biol Cell, 2008, 19: 2003-2013. [15]Zhang HZ, Wang Y, Gao P, et al. Silencing stathmin gene expression by survivin promoter-driven siRNA vector to reverse malignant phenotype of tumor cells. Cancer Biol Ther, 2006, 5: 1457-1461. [16]Su D, Smith SM, Preti M, et al. Stathmin and tubulin expression and survival of ovarian cancer patients receiving platinum treatment with and without paclitaxel. Cancer, 2009, 115: 2453-2463. (收稿日期：2010 -06 -03) (本文编辑：朱红梅) 中华医学会肝脏病杂志版权 |