【摘要】 目的 探讨微小RNA-221（miR-221）对肝癌细胞株HepG2细胞增殖与凋亡的影响。方法 将miR-221阻遏物及模拟物转染至HepG2后，用实时荧光定量RT-PCR检测miR-221的表达水平；用细胞增殖试剂盒、Hoechst 33342及碘化丙啶（PI）双重染色、流式细胞仪及caspase3/7活性试剂盒检测HepG2细胞增殖与凋亡情况。对数据进行多样本的单因素方差分析，两两比较采用LSD法；相关性比较用Pearson检验。 结果 RT-PCR结果显示，转染miR-221阻遏物后其表达受到抑制，而转染miR-221模拟物可促进其表达。细胞增殖试剂盒及Hoechst 33342/PI染色结果显示，48 h后miR-221阻遏物明显抑制HepG2细胞增殖（ P < 0.05），而miR-221模拟物促进HepG2细胞增殖（ P < 0.05），两种方法结果呈正相关（ r = 0.993，P < 0.01）。流式细胞仪检测细胞周期显示，miR-221模拟物组G1期细胞比例（47.67%±1.53%）明显低于空白对照组（59.00%±1.00%）及阴性对照组（58.00%±1.00%， F = 81.77，P < 0.01）；S期细胞比例（20.33%±1.15%）明显高于空白对照组（11.00%±1.00%）及阴性对照组（12.00%±1.00%， F = 70.90，P < 0.01）。 Hoechst 33342/PI染色、 流式细胞仪膜联蛋白V凋亡试剂盒检测均显示，转染miR-221阻遏物48 h后，细胞凋亡和坏死增加（ P < 0.05），差异有统计学意义。Caspase-3/7试剂盒检测caspase-3/7活性变化结果显示，转染miR-221阻遏物24 h后，细胞caspase3/7活性明显增高（ P < 0.05），差异有统计学意义。 结论 miR-221可促进肝癌细胞生长增殖，抑制miR-221表达可诱导细胞凋亡。miR-221有望成为治疗肝癌新的分子靶点之一。 【关键词】 癌，肝细胞； 细胞凋亡； 微小RNA-221 Effect of miR-221 on the viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells CHEN Gang, DANG Yi-wu, LUO Dian-zhong. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China Email: chen_gang_triones@163.com 【Abstract】 Objective To investigate the effect of microRNA-221 (miR-221) on cell viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells. Methods MiR-221 inhibitors and mimics were transfected into HepG2 cells. The expression of miR-221 was detected by real time quantitative RT-PCR. CellTiter-blue cell viability kit, Hoechst 33342/propidium iodide (PI) double staining assay, flow cytometry and Apo-ONE homogeneous caspase-3/7 kit were used to measure cell viability and apoptosis. Results MiR-221 inhibitors significantly inhibited the cell growth and miR-221 mimics increased cell viability 48 hours post-transfection measured by both CellTiter-blue cell viability kit and Hoechst 33342/PI assay ( P < 0.05) . There was a positive correlation between these two assays( r = 0.993, P < 0.01) . With miR-221 mimics, the number of G1 stage cells (47.67% ± 1.53%) was significantly reduced as compared to the blank control (59.00% ± 1.00%) and the negative control (58.00% ± 1.00%, F = 81.77, P < 0.01) , and it was significantly raised in S stage (20.33% ± 1.15%) than in blank control (11.00% ± 1.00%) and negative control (12.00% ± 1.00%, F = 70.9, P < 0.01) with flow cytometry analysis. More cell apoptosis and necrosis were significantly induced by miR-221 inhibitors 48 hours post-transfection detected by both Hoechst 33342/PI assay and flow cytometry PE Annexin V kit ( P < 0.05). The result from Apo-ONE homogeneous caspase-3/7 kit was consistent with the above two apoptotic assays, which showed that with miR-221 inhibitors, the activity of caspase-3/7 was significantly enhanced ( P < 0.05). Conclusions MiR-221 contributes to the growth of hepatocellular carcinoma cells and miR-221 inhibition can induce cell apoptosis. miR-221 has the potential to become one of the new molecular targets for liver cancer therapy. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Apoptosis; MicroRNA-221 微小RNA(microRNA， miRNA)是一类约22个碱基的小分子非编码RNA，对正常的生长发育及疾病发生有重大影响，已成为近年来生命科学新的研究热点。miRNA通常与下游靶基因信使RNA(messenger RNA， mRNA)的3′非翻译区结合，从而促使靶基因降解或抑制其翻译，在多种肿瘤的发生、发展中作用显著。本课题组及其他课题组曾报道miR-221在原发性肝细胞癌(HCC)细胞株及组织中呈高表达，并与HCC发生密切相关[1-5]。新近开发的人工合成miRNAs阻遏物和模拟物，可抑制或增强内源性成熟miRNAs的效应，从而成为研究miRNAs功能的一个强有力的工具。为进一步研究miR-221对HCC细胞生物学特性的作用机制，本研究将miR-221阻遏物及模拟物转染至HepG2细胞后，检测其对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。 材料与方法 1． 细胞株及其培养：人肝癌细胞株HepG2细胞、HepB3细胞与SNU449细胞、SNU398细胞均购自美国ATCC公司，分别用DMEM与RPMI 1640 培养液 (均购自美国Gibco公司)培养。 2. 实验分组：前期实验结果显示HepG2、HepB3、SNU449及SNU398细胞均有不同程度的miR-221表达(另文发表)，本实验只选取HepG2细胞为代表进行后续实验。空白对照组为加入转染试剂但无阻遏物或模拟物； 阴性对照组包括miRNA阻遏物阴性对照与miRNA模拟物阴性对照（试剂购自美国Applied Biosystems公司)；实验组分别转染靶向miR-221的阻遏物或模拟物（购自美国Applied Biosystems公司)；Tox转染阳性对照（购自比利时Thermo Scientific Dharmacon公司） 为增殖与凋亡实验的阳性对照。每组实验重复6次。 3. 转染：前期实验已优化相关的转染方法，即在24孔板中每孔用2μl combiMAGnetofection（磁性转染法，购自德国Chemicell公司）、1.5μl liper-fectamine 2000（购自比利时Invitrogen公司）、200 nmol/L miRNA阻遏物或模拟物进行反向转染。与传统的正向转染不同，反向转染在消化细胞、调整细胞浓度为5×104个/孔后，将细胞悬液加入含有miRNA阻遏物或模拟物混合液以及磁性纳米微粒溶液的培养板中。用该方法转染与细胞增殖、凋亡无关的miR-191阻遏物后检测细胞存活率高，证明该转染方法细胞毒性小(结果未显示)。同时使用该转染条件，经siGLO（购自比利时Thermo Scientific Dharmacon公司）转染后在荧光显微镜下计数法证实，转染率24 h均超过65%，48 h均超过77%，72 h均超过85%，96 h均超过88% (结果未显示)。 4. 实时荧光定量RT-PCR: 分别收获0、24、48、72 h及96 h各组细胞，用ABI PRISM 6100 prepstation 法抽提各实验组细胞的总RNA，用ND-1000 NanoDrop检测RNA质量及浓度。取200 ng总RNA作为模板，miR-221、RNU6B与let-7a的逆转录反应体系： 100 nmol/L dNTPs 0.15μl、 50 U/μl 的MultiScribe逆转录酶1μl、10×逆转录缓冲液1.5 μl、20 U/μl 的RNA酶抑制剂0.19 μl、特异性逆转录引物3μl，加无RNA酶水至15μl。逆转录反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；收集cDNA，-80 ℃保存备用。miR-221茎环状逆转录特异引物、miRNA内参照RNU6B与let-7a引物由美国Applied Biosystems公司合成。miR-221、RNU6B与let-7a的PCR反应体系：取2μl cDNA为模板，TaqMan 2×Universal PCRMaster Mix 10μl(购自美国Applied Biosystems公司)，含特异性上、下游引物及探针的Taqman microRNA Assay 1μl(购自美国Applied Biosystems公司)，加无RNA酶水至20μl。ABI-Prism 7900HT PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。PCR条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。成熟hsa-miR-221序列：5′-AGCUACAUUGUCUGCUGG GUUUC-3′(miRBase Accession:MIMAT0000278)。采用ΔΔCq法分析转染结果，RNU6B与let-7a的Cq平均值为实验内参照，其中miR-221的ΔCq = CqmiR-221-Cq内参照，ΔΔCq = ΔCqmiRNA 组-ΔCq对照组[6]。 5. 细胞增殖检测：细胞增殖情况按CellTiter-Blue细胞增殖试剂盒（购自美国Promega公司）说明书进行检测。用96孔板接种细胞5000个/孔，次日换细胞培养液(100μl/孔)，并按上述实验分组进行处理。不同时间点（0、24、48、72 h及96 h）处理后每孔加入CellTiter-Blue 20μl，37 ℃孵育2 h，在波长为560 nm/590 nm下荧光检测。细胞增殖率=实验组荧光值/空白组荧光值×100%。 6. 荧光显微镜检测细胞增殖凋亡情况：细胞经上述分组处理后，用Hoechst 33342及碘化丙啶（PI，购自比利时Sigma公司，终浓度均为1 mg/ml)进行荧光双重染色，在荧光显微镜下观察并拍照。该系统可辨别活细胞(Hoechst 33342阳性/PI阴性)、早期凋亡细胞 (Hoechst 33342阳性/PI阴性，镜下见细胞由数个蓝色小点组成)、中晚期凋亡细胞 (Hoechst 33342阳性/PI阳性，镜下可见细胞由蓝色、红色小点或者只有红色小点组成， 早中期凋亡细胞均具有核固缩、染色质浓集以及凋亡小体形成等形态特点)、坏死细胞 (Hoechst 33342阴性/PI阳性)。各组细胞均在200倍下随机计数10个视野/孔，计算平均值。凋亡细胞数为早期及中晚期凋亡细胞数总和。各组细胞增殖率为活细胞数与空白对照组活细胞数之比；各组凋亡细胞数对比相应的活细胞数计算出各组凋亡率，并与空白对照组数据对比计算出相对凋亡比例。 7. 流式细胞仪检测: 细胞分组处理后PI染色，流式细胞仪行单参数分析，用Multicycle软件分析细胞周期分布。用藻红蛋白（PE）标记的膜联蛋白（Annexin）V凋亡检测试剂盒（购自比利时BD Pharmingen公司）检测凋亡情况，其中Q2为PE-Annexin V阳性/7-AAD阴性的早期凋亡细胞，Q4为PE-Annexin V阳性/7-AAD阳性的中晚期凋亡细胞及坏死细胞。计算各实验组Q2 + Q4凋亡及坏死细胞总和。 8. Caspase -3/7活性检测：Caspase -3/7活性检测按Apo-ONE试剂盒（购自美国Promega公司）说明书进行。在增殖检测完后，每孔加入120 μl caspase溶液，37℃孵育30 min，在波长为499 nm/521 nm 下荧光检测。caspase-3/7 荧光读数对比相应的增殖读数为该孔最后的caspase-3/7比率，并与空白对照组荧光值比较。 9. 统计学方法:计量资料以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS19.0软件进行多样本的单因素方差分析，两两比较采用LSD法；相关性比较用Pearson检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 转染情况：实时荧光定量RT-PCR检测发现转染miR-221阻遏物后，miR-221表达减少， Cq值增大，96 h时ΔΔCq为1.8；转染miR-221模拟物后，miR-221表达增加，Cq值减小，96 h时ΔΔCq为-9.7， 转染成功(图1)。 2. miR-221对HepG2细胞增殖及细胞周期的影响：用细胞增殖试剂盒及Hoechst 33342/PI双重染色荧光显微镜下计数检测细胞增殖情况，结果显示，miR-221阻遏物抑制细胞增殖，而miR-221模拟物促进细胞增殖（表1，2）；两种实验方法结果呈正相关（ r = 0.993， P < 0.01）。流式细胞仪检测细胞周期显示，miR-221模拟物组G1期细胞比例（47.67%± 1.53%）明显低于空白对照组（59.00%±1.00%）及模拟物阴性对照组（58.00%±1.00%， F = 81.77， P < 0.01）；miR-221模拟物组S期细胞比例（20.33%± 1.15%）明显高于空白对照组（11.00%±1.00%）及模拟物阴性对照组（12.00%±1.00%， F = 70.90，P < 0.01）。 3. miR-221对HepG2细胞凋亡及caspase -3/7活性的影响：Hoechst 33342/PI双重染色检测细胞凋亡，结果显示，转染miR-221阻遏物后，细胞凋亡和坏死增加(表3，图2)。用流式细胞仪PE-Annexin V 凋亡试剂盒检测显示（图3）：转染miR-221阻遏物96 h后，HepG2 细胞凋亡及坏死细胞比例(Q2+Q4，20.33%±0.84%）明显高于阻遏物阴性对照组（13.93%±0.74%，t = -6.4， P < 0.01）；miR -221模拟物组（11.70%±0.30%）低于模拟物阴性对照组（13.37%±0.57%， t = 1.667， P < 0.05）。用Apo-ONE caspase -3/7试剂盒检测caspase -3/7活性变化结果显示，转染miR-221阻遏物后，HepG2细胞caspase -3/7活性明显增高(表4)。Hoechst 33342/PI染色、流式细胞仪PE Annexin V/7-AAD检测及caspase -3/7活性检测结果均呈正相关，其中Hoechst 33342/PI 与 PE Annexin V/7-AAD， r = 0.995，P < 0.01； Hoechst 33342/PI与caspase -3/7， r = 0.966，P < 0.01； PE-Annexin V /7-AAD 与caspase -3/7， r = 0.99，P < 0.01。 讨 论 HCC是我国常见的恶性肿瘤，其发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。探寻HCC发生、发展的相关基因，了解其分子遗传学机制，从而为诊断、治疗提供理论基础为目前的研究热点。不同的miRNA在HCC的发生与发展、浸润与转移、预后中发挥不同的作用[7]。MiR-221在HCC和其他癌症中表达上调[1-5]。本课题组用miRNA芯片技术发现在HepG2细胞中，miR-221的表达明显高于正常肝细胞株细胞及正常肝组织。Gramantieri等[2]用含有381种人类miRNA的芯片检测17例HCC和21例肝硬化肝组织标本， 与肝硬化组织相比， miR-221在83%的HCC中上调， 并用Northern blot及RT-PCR进一步验证了该结果。Pineau等[4]用miRNA芯片技术及Fu等[5]用原位杂交技术均发现类似的结果，即miR-221在HCC中高表达，提示miR-221在HCC的发生中发挥重要作用，扮演着“癌基因(oncogene)”的角色。 Pineau等[4]用miR-221 antagomiR转染HLE细胞后通过细胞克隆实验发现细胞克隆减小，细胞生长减慢；转染miR-221前体后细胞克隆增大，细胞生长增快。同时，转染miR-221 antagomiR入Malhavu细胞后，用MTT法检测细胞增殖抑制率为35%，但是同样的处理在FOCUS、PLC/PRF5及Huh6肝癌细胞中作用甚微。本研究用反向combiMAGnetofection转染法将miR-221阻遏物或模拟物转染至HepG2细胞中，通过Hoechst 33342/PI双重荧光染色及Cell Titer细胞增殖试剂盒两种方法检测细胞增殖，结果与Pineau等[4]在部分肝癌细胞株中的发现一致，即miR-221可促进肝癌细胞的增殖。通过检测细胞周期改变结果显示，miR-221可使更多的HepG2细胞处于DNA合成的S期，进一步确认了该miRNA促增殖的特性。Fornari等[8]报道周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI) 1C/p57和CDKI1B/p27是miR-221的靶基因，故miR-221通过负向调控这两个CDKI蛋白的表达，导致更多的癌细胞处于细胞周期的S期。 不同研究组对miR-221与HCC细胞凋亡的关系有不同的报道。Dai等[9]报道miR-221模拟物增强了肝癌细胞由内质网应激导致的细胞凋亡，miR-221阻遏物作用相反。但Gramantieri等[3，10]则报道敲低miR-221后，肝癌细胞SNU449的凋亡增加了，同时该课题组发现与凋亡相关的Bmf也是miR-221的分子靶标，从而解释了miR-221可通过影响Bmf蛋白的表达而抑制细胞凋亡。本研究通过Hoechst 33342/PI双重荧光染色及流式细胞仪PE-Annexin V/7-AAD两种方法检测HepG2细胞凋亡情况，结果与Gramantieri等[3，10]在SNU449肝癌细胞中的发现一致。同时，caspase -3/7活性变化与凋亡实验结果呈正相关，提示miR-221可抑制肝癌细胞HepG2的凋亡。 综上所述，miR-221在肝细胞癌中具有致癌作用，它可能通过下调细胞周期蛋白激酶抑制剂的表达水平从而促进癌细胞生长，和（或）通过调节Bmf的表达水平而抑制细胞凋亡。由于miR-221在HCC中的高表达及与细胞增殖和凋亡密切相关，miR-221有望成为HCC基因治疗的新靶点。、 参 考 文 献 [1]Li J, Wang Y, Yu W, et al. 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