【关键词】 肝； 微透析； 代谢解毒，药物； 肝组织间液； 病理生理物质 Hepatic microdialysis technique and its application in hepatic relevant material assay PAN Xu-wang, TIAN Jing, JIANG Xiao-qin. 【Key words】Liver; Microdialysis; Metabolic detoxication, drug; Hepatic interstitial fluid; Pathological and physiological material 【First author’s address】The Sixth Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310014, China Corresponding author: TIAN Jing, Email: hztj2002@ yahoo.com.cn 1972年，Delgado等[1]首次报道了真正意义上的组织微透析（microdialysis，MD）技术。此后，在科研人员的努力下，MD技术不断发展，逐渐形成了相互交叉的分支，如肾MD技术[2]、小鼠MD技术[3]等。近年来，MD技术也逐渐应用于药物肝组织代谢等方面的研究，以及肝细胞间液病理生理活性物质监测，尤其在肝脏移植的器官保存、术后早期并发症的监测中应用较多[4-6]，并已展现出可喜的前景。 一、肝MD技术 肝MD系统由微量注射泵、微透析导管、微量收集瓶、分析仪4部分组成。微透析导管直径约1mm，是一根很细但可以双向流动的同心软塑料管。导管顶端外层管壁用半透膜物质做成，最大可允许相对分子质量为2×103的物质通过。灌流液由微透析泵驱动在外部的管道流动，通过透析膜与细胞间液进行交换，在导管的末端，通过扩散作用与细胞间液达到平衡的透析液经过一个小孔进入内管回流，最后收集在微量收集瓶里，定时更换收集瓶，将收集的透析液在分析仪内进行检测，通过测定透析液中待测物的浓度来研究肝细胞间液中待测物的水平。 二、肝MD技术在药物肝组织代谢研究中的应用 与传统的组织匀浆法相比，MD取样技术不仅能更准确研究某一时间点药物在肝脏内的代谢情况，而且还可以研究药物在单个动物肝脏中的实时代谢变化过程。根据物质跨膜扩散的双向性，肝MD技术也可向肝脏传递药物以研究局部给药在肝脏的代谢情况。 Tsai等[7]利用肝MD技术研究了小檗碱在大鼠肝脏内的代谢，透析液经液相色谱分析，代谢产物的结构则用液相层析串联质谱进行鉴定，结果表明：P-糖蛋白和P450酶系在小檗碱的代谢和排泄中起着重要作用，环抱素A、奎尼丁、SKF-525A（普罗地芬）也会对小檗碱的代谢产生影响；小檗碱在肝脏中代谢的第I相生物转化是去甲基，第Ⅱ相生物转化是与葡萄糖醛酸的结合反应。 Solen等[8]研究了苯酚在鱼肝脏的代谢，发现通过MD探针以1μg/min的流速灌注苯酚（l～300mmol/L）到肝脏，随着灌流时间和转运到肝脏的苯酚浓度增加，苯酚第I相代谢产物对苯二酚（HQ）和邻苯二酚（CAT）浓度也增加了。 利用肝MD技术还可以在不同器官同时进行药物的代谢研究。Ekstro/m等[9]将探针埋入麻醉大鼠血、肝及肾中，同时取样，研究甲氨蝶呤与萘普生的相互作用，同时监测了甲氨蝶呤的主要代谢物7-羟基-甲氨蝶呤。Tsai等[10]用HPLC和探针同时检测黄连素在血液、肝脏和胆汁中的浓度，检测限大于10ng/ml，线性和精密度都很好，并且证明了黄连素是经过肝脏和胆汁代谢和排泄。 肝MD技术还可在肝不同区域同时埋植探针进行代谢研究，空间分辨率高。Davies和Lunte[11]将MD探针埋入大鼠肝中叶的前、中、后3个不同位点进行代谢区域变化的研究，探针之间间隔1cm，实验证明探针之间没有流通，静脉注射苯酚后，观察3个位点的代谢轮廓，可以观察到相对于中间及后面位置的探针，前面位置的探针所监测到的Ⅱ相代谢物明显较低，消除动力学在这些位置上无明显区别。当苯酚通过MD探针进入肝脏后，在3个区域内苯酚的分布及代谢物的形成无明显区别，这一实验证明肝MD探针可以在像肝这样的大器官上同时对空间相近的不同区域进行取样研究，原药也可以通过MD探针进入周围组织，而代谢物通过探针被收集进行局部代谢研究。 三、肝MD技术在肝细胞间液物质测定中的应用 利用MD技术可以检测细胞间液的生化变化，从而监测肝细胞的代谢情况，广泛应用于缺血-再灌注过程中肝脏代谢物质的监测及肝脏移植过程中病理生理物质的测定[12-21]。 Kannerup等[12]在肝左叶和右叶分别植入探针，监测猪肝脏在缺血预适应后局部热缺血-再灌注过程中的代谢变化，结果表明局部缺血时甘油和葡萄糖显著升高，再灌注开始时下降；局部缺血期间乳酸水平显著升高，并在再灌注期间下降；乳酸-丙酮酸比率在局部缺血时显著升高，并在再灌注期间剧烈下降；肝脏各参数只显示微小变化。 Ungerstedt等[14]用肝MD技术连续监测了在闭合肝动脉或门静脉时猪肝脏代谢情况：在肝动脉闭合组，葡萄糖、乳酸、甘油和乳酸/丙酮酸比率在2h的脉管闭合期间显著升高，并在3h的再灌注过程中回到基线水平；在门静脉闭合组，这些代谢产物在实验过程中保持稳定。实验表明，肝MD技术适用于肝脏手术中肝内代谢物质变化的监测。 Waelgaard等[16]用相对分子质量为1×105滤膜的MD探针监测肝移植后的局部炎症反应。将MD探针植入肝叶皮下，并监测了有关代谢参数（葡萄糖、丙酮酸、甘油、乳酸）、细胞活素类（白细胞介素-6、白细胞介素-8、单核细胞趋化因子-1、诱导蛋白质-10）和补体激活（C5a）等的水平，实验表明相对分子质量为1×105滤膜的MD探针在肝移植后炎性反应监测方面有较好的应用前景。 Silva等[4]研究了缺血-再灌注对移植肝功能的影响：移植肝再灌注开始后马上植入MD探针，并用等渗溶液灌注48h，监测缺血再灌注产物葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油等的浓度水平，以及丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、牛磺酸等氨基酸的浓度水平，结果表明，术后乳酸、丙酮酸和甘油浓度较高，之后快速下降，最终稳定在基线水平；丙氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸的浓度迅速下降至基线水平；精氨酸浓度在刚灌注时较低，之后升高，19h之后达到较高水平。 Huang等[21]比较了肝MD技术和重复取血这两种方法在研究白血病大鼠肝一氧化氮（NO）和全身NO合成中的应用，微透析组大鼠在肝脏和右心房分别插入MD探针，每30min收集一个样品，采血组每30min采血0.3ml。分析采集部位的血流动力学，肝和全身的NO浓度及一氧化氮合酶表达，结果表明，自体重复采血导致血压显著下降，并诱导了肝一氧化氮合酶表达，而MD技术可靠地监测到了NO，而没有引起肝组织血流动力学的改变和一氧化氮合酶激活。 四、前景 肝MD技术是一项新兴且用途广泛的肝脏学研究技术，非常适合于监测肝内组织间液中的药物浓度及其代谢变化或病理生理活性物质，尤其如腺苷、一氧化氮等半衰期短，浓度低，而且极易分解代谢的物质。药物在肝组织的代谢及肝移植不同阶段移植肝的代谢情况，对于药物体内过程研究及移植肝的预后评价非常重要。因此，监测肝内组织间液中的药物及其代谢产物或病理生理活性物质对于肝脏学研究具有重要意义。近十余年来，肝MD技术作为一种有效的肝脏学研究手段，发展迅速，不断改进，目前在肝生理学、肝脏药理学、肝移植等方面得到了广泛的应用。但不可否认，该技术仍存在探针植入手术对肝组织的损伤、透析液微量分析方法的灵敏度等问题，使该技术的应用仍有一定的局限性。随着该领域研究工作的不断深入，例如肝MD技术与各种检测技术有机结合形成在线检测系统，肝MD技术在肝移植后床旁检测系统的不断成熟，肝MD技术在肝脏学研究中将会有更广阔的应用前景。 参 考 文 献 [1]Delgado JM, DeFeudis FV, Roth RH, et al. Dialytrode for long term intracerebral perfusion in awake monkeys. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1972, 198: 9-21. [2]Pan XW, Li FZ. Renal microdialysis technique and the use of it in adenosine determination in renal interstitial fluid. Zhonghua Yixue Zazhi, 2006, 86: 1221-1223.(in Chinese) 潘旭旺,李范珠.肾微透析技术及其在肾组织间液腺苷测定中的应用.中华医学杂志，2006,86:1221-1223. [3]Li FZ, Pan XW. Microdialysis in mice and its application in drug delivery system. Yaoxue Xuebao, 2006, 41 : 921- 926. (in Chinese) 李范珠,潘旭旺.小鼠微透析技术及其在药物传递系统中的应. 药学学报，2006,41:921-926. [4]Silva MA, Richards DA, Bramhall SR, et al. A study of the metabolites of ischemia-reperfusion injury and selected amino acids in the liver using microdialysis during transplantation. Transplantation, 2005, 79: 828-835. [5]Sommer T, Larsen JF. Intraperitoneal and intraluminal microdialysis in the detection of experimental regional intestinal ischaemia. Br J Surg, 2004, 91: 855-861. [6]Nowak G, Ungerstedt J, Wernerman J, et al. Clinical experience in continuous graft monitoring with microdialysis early after liver transplantation. Br J Surg, 2002, 89: 1169-1175. [7] [8]Solen LE, Kolanczyk RC, Mckim JM. An in vivo microdialysis method for the qualitative analysis of hepatic phase I metabolite of phenol in rainbow trout(Oncorhnchus mykiss). Aquat Toxicol, 2003, 62: 337-347. [9]Ekstr鴐 PO, Giercksky KE, Andersen A, Sl鴕dal L. Alterations in methotrexate pharmacokinetics by naproxen in the rat as measured by microdialysis. Life Sci, 1997, 60: PL359-364. [10]Tsai P, Tsai TH. Simultaneous determination of berberine in rat blood, liver and bile using microdialysis coupled to high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 2002, 961: 125-130. [11]Davies MI, Lunte CE. Simultaneous microdialysis sampling from multiple sites in the liver for the study of phenol metabolism. Life Sci, 1996, 59: 1001-1013. [12]Kannerup AS, Gr鴑b鎘 H, Funch-Jensen P, et al. The influence of preconditioning on metabolic changes in the pig liver before, during, and after warm liver ischemia measured by microdialysis. Hepatol Int, 2009, 3: 310-315. [13]Winbladh A, Sandstr鰉 P, Olsson H, et al. Segmental ischemia of the liver - microdialysis in a novel porcine model. Eur Surg Res, 2009, 43: 276-285. [14]Ungerstedt J, Nowak G, Ungerstedt U, et al. Microdialysis monitoring of porcine liver metabolism during warm ischemia with arterial and portal clamping. Liver Transpl, 2009, 15: 280-286. [15]Kannerup AS, Funch-Jensen P, Gr鴑baek H, et al. Metabolic changes in the pig liver during warm ischemia and reperfusion measured by microdialysis. J Gastrointest Surg, 2008, 12: 319-326. [16]Waelgaard L, Thorgersen EB, Line PD, et al. Microdialysis monitoring of liver grafts by metabolic parameters, cytokine production, and complement activation. Transplantation, 2008, 86: 1096-1103. [17]Silva MA, Mirza DF, Murphy N, et al. Intrahepatic complement activation, sinusoidal endothelial injury, and lactic acidosis are associated with initial poor function of the liver after transplantation. Transplantation, 2008, 85: 718-725. [18]Richards DA, Silva MA, Murphy N, et al. Extracellular amino acid levels in the human liver during transplantation: a microdialysis study from donor to recipient. Amino Acids, 2007, 33: 429-437. [19]Silva MA, Mirza DF, Buckels JA, et al. Arginine and urea metabolism in the liver graft: A study using microdialysis in human orthotopic liver transplantation. Transplantation, 2006, 82: 1304-1311. [20]Peltz C, Schroeder T, Dewhirst MW. Monitoring metabolite gradients in the blood, liver, and tumor after induced hyperglycemia in rats with R3230 flank tumors using microdialysis and bioluminescence imaging. Adv Exp Med Biol, 2005, 566: 343-348. [21]Huang CJ, Tsai PS, Pan WH, et al. Microdialysis for measurement of hepatic and systemic nitric oxide biosynthesis in septic rats. Acta Anaesthesiol Scand, 2005, 49: 28-34. (收稿日期：2009-11-19） （本文编辑：金生） |