【关键词】 骨髓干细胞； 慢性肝衰竭； 细胞移植； 临床试验 Research development of bone marrow stem cells for chronic liver failure treatment YANG Fan, QIN Bo. 【Key words】 Bone marrow stem cells; Chronic liver failure; Cell transplantation; Clinical trials 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, the First Hospital Affiliated to Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China Corresponding author: QIN Bo, Email: cqqinbo@126.com 肝移植是治疗慢性肝衰竭（chronic liver failure，CLF）的有效手段，但因各种原因，其临床应用逐渐受到限制，探索新的治疗手段迫在眉睫。1996年Alison等诱导人骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）分化肝细胞获得成功，推动了BMSCs治疗CLF研究的快速发展。由于自体BMSCs具有资源丰富、无需抗排斥、费用低廉、风险较小等优势，越来越被期待成为肝移植的过渡甚至替代治疗措施。 一、 BMSCs治疗CLF的机制研究 BMSCs治疗CLF的基础研究主要包括以下几个环节，即内源性BMSCs的动员、外源性自体BMSCs移植亚群及途径的选择、BMSCs的肝脏归巢以及对受损肝脏的修复。 1. BMSCs向受损肝脏归巢：肝脏遭受慢性损伤是BMSCs长期稳定动员并向肝脏归巢的关键前提。Cho等[1]报道，在正常小鼠肝、脾、肺中BMSCs分布无明显差异，但经四氯化碳处理后的肝脏归巢率是对照组的2倍多，明显高于脾、肺归巢率。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/CXCR4轴被认为是BMSCs归巢的中心环节，它不仅可以通过水解骨髓内SDF-1和造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）表面CXCR4末端，促进BMSCs向外周动员，而且可以上调基质金属蛋白酶（MMP）-9的表达，引起可溶性Kit配体释放，诱导BMSCs肝脏归巢。小鼠肝内胆管上皮、卵原细胞等也可以表达SDF-1和CXCR4，表明SDF-1/CXCR4轴还可能参与肝干细胞的迁移与分化。由于间充质干细胞很少表达活性CXCR4，目前尚无间充质干细胞MSCs通过SDF-1/CXCR4轴介导肝脏归巢的体内研究报道[2]。Son等[3]研究证实hMSCs肝脏归巢主要是受肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）/c-met轴调控。此外，还有其他调控因子如肝内干细胞因子、白细胞介素-8等也参与归巢调控；最近我国学者在假设基础上还成功证实了鞘氨醇1-磷酸盐浓度梯度与BMSCs肝脏归巢之间存在关联[4]，但目前尚不清楚是否与SDF-1/CXCR4轴或HGF/c-met轴等有关，有待进一步研究。 2. BMSCs对受损肝脏修复：BMSCs与肝细胞相互作用是继归巢之后治疗CLF的关键环节，主要表现在两大方面，即转化为肝细胞和减轻肝纤维化。（1）BMSCs转化为肝细胞：大量研究已证实BMSCs能转化为成熟肝细胞，涉及其中的主要机制有：转分化和细胞融合。转分化即BMSCs转变成肝实质细胞。Khurana和Mukhopadhyay[5]在体外将HSCs培养成与原代肝细胞在微结构方面极其相似的功能性肝细胞。转分化机制跨越了划定的系谱分界线，打破了细胞生物学特点，所以科学界对此持有疑义，有学者认为可能是体外培养时的人工假象，也有认为其实就是细胞融合过程。根据目前所获证据，BMSCs转分化为肝实质细胞的报道较少，但其向肝星状细胞（hepatic stellate cell，HpSC）或肌纤维母细胞（myofibroblast，MFB）转分化却被广泛证实[6]，提示BMSCs治疗CLF存在潜在风险。细胞融合即BMSCs与受损肝细胞发生融合形成过渡状态的嵌合细胞，随之发生减数分裂转化为含有正常数目染色体的肝实质细胞。Alvarez-Dolado等[7]在成熟肝实质细胞中发现有来源于骨髓供体的基因组分。Quintana-Bustamante等[8]利用绿色荧光蛋白（GFP）标记的BMSCs进行雌雄小鼠交叉移植，在受体肝脏内鉴定出双核/Y染色体+/GFP+功能性肝细胞。目前细胞融合机制被普遍认为是BMSCs转化为成熟肝细胞的主要方式和首要机制，由于嵌合细胞染色体呈多倍性且不稳定，所以BMSCs治疗存在致癌风险，但目前鲜见报道。（2）BMSCs减轻肝纤维化：HSC激活是肝纤维化发生的重要机制之一，研究显示BMSCs减轻肝纤维化主要是通过旁分泌机制抑制HSC激活或（和）促进其凋亡，也有少数自分泌机制的报道。早有报道BMSCs通过减少转化生长因子（TGF）β1抑制HSC激活。Parekkadan等[9]发现MSCs分泌肿瘤坏死因子、白细胞介素-10抑制HpSC激活，释放HGF促进HSC凋亡。Qu等[10]证实肿瘤坏死因子α也能促进HSC凋亡。Lan等[11]又发现被转染白细胞介素-10基因的BMSCs可以抑制大鼠HSC激活。神经生长因子和一氧化氮也能引起HSC凋亡[12]，最近我国学者证实hMSCs通过分泌神经生长因子并与其受体P57NTR结合诱导hHSC凋亡[13]，Ren等[14]发现炎症因子刺激小鼠MSCs表达一氧化氮合成酶，通过一氧化氮促进HSC凋亡。细胞外基质的合成和降解失衡是肝纤维化发生的另一重要机制，主要受MMP增多或（和）金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）减少来决定的。虽然目前尚无BMSCs引起MMP、TIMP改变的报道，但在心肌梗死动物模型中已发现TIMP明显减少，这方面有待在肝病模型中得到鉴定。 二、BMSCs治疗CLF的动物实验 目前认为BMSCs治疗CLF主要是通过促进肝细胞再生和减轻肝纤维化程度以达治疗目的。Oyagi等[15]将体外已被诱导成具有肝细胞表型的MSCs植入肝损模型后发现肝纤维化减轻、Alb水平升高；Abdel Aziz等[16]研究证实MSCs可以提高肝损模型的Alb水平、降低ALT，并发现MSCs组肝内胶原含量仅为（30.64±4.11）μg/g，而对照组为（133.32±20.56）μg/g（P<0.01）。 虽然肝脏受损后BMSCs的归巢率比正常时明显提高，但总体上仍处于低水平，转分化或细胞融合等方式补充的肝细胞数量远低于CLF对肝细胞再生的需求，所以BMSCs还存在其他途径改善肝功能，通过研究发现BMSCs移植时肝细胞再生主要来自内源性肝细胞[17]，这可能与BMSCs通过旁分泌启动或触发内源性肝修复程序有关。然而，科学家们还发现BMSCs是MFB重要的肝外来源。Russo等[6]对肝损模型进行性别交叉BMSCs移植，发现来源于BMSCs的HpSC和MFB分别占68%和70%，并证实是起源于MSCs；Kisseleva等[18]将BMSCs移植后出现在受损肝脏内的骨髓源性细胞与TGFβ1共培养，发现骨髓源性细胞可以分化为α-平滑肌肌动蛋白+/结蛋白+的MFB。关于损伤肝脏中骨髓源性MFB是来源于HSCs或MSCs还是共同参与，目前尚未明确，但有学者认为主要是来源于后者。近年不少实验研究得出MSCs不能减轻肝纤维化和改善肝功能的结论。Carvalho等[19]对肝硬化大鼠分别接受MSCs和安慰剂，结果显示两组在移植后2个月内肝功能无明显差异，胶原区域百分比分别在移植后1个月和2个月进行比较，差异也无统计学意义。所以，当前BMSCs能否在长时间内有效减轻肝纤维化、改善肝功能、提高生存率等方面仍然无法得到明确答案，尚需进行大规模、长时间的研究观察。 三、BMSCs治疗CLF的临床试验 am Esch等[20]为了提高肝癌患者行扩大肝右叶切除术后的生存率，第一次尝试联合自体BMSCs移植对4位肝癌患者进行术前处理，有3例顺利实行手术，开创了BMSCs临床应用的先河。近年BMSCs治疗CLF的临床试验在国内外相继开展。早期技术路线主要是通过皮下注射粒细胞集落刺激因子，动员内源性BMSCs向肝脏归巢，Gaia等[21]对8例失代偿肝硬化患者的试验结果显示近一半患者Child-Pugh、终末期肝病模型（MELD）分值下降，腹水和肝性脑病发作频率明显减少。当前更多采用的技术路线为体外选择性BMSCs移植，获取BMSCs的方式主要存在两种，一是经粒细胞集落刺激因子动员后从外周血收集，二是从骨髓获取，而选择性主要反映在BMSCs亚群的不同。 1. 国外临床试验：Gordon等[22]和Levicar等[23]报道5例肝硬化患者接受CD34+移植并随访6～18个月，其中有4例肝功能好转；Yannaki等[24]观察接受CD34+移植的2例失代偿肝硬化患者，30个月后Child-Pugh、MELD分值分别平均下降1和8；Terai等[25]的研究也发现肝功能好转，并在移植后4周行肝活检，发现甲胎蛋白、增殖细胞核抗原表达增加。Kharaziha等[26]对8例CLF进行MSCs移植，6个月后MELD分值由17.9±5.6下降至10.7±6.3（P＜0.05），腹水明显减少，且随访期间未发作肝性脑病。然而，Mohamadnejad等[27]先后进行了HSCs、MSCs移植的临床研究，发现HSCs移植疗效令人遗憾，6个月后仅有1例MELD分值下降，并有1例死亡，认为死亡原因可能与肝动脉造影导致放射性肾病有关。此外，BMSCs治疗肝病的临床试验报道还有单核细胞移植以及CD34+移植治疗急性肝衰竭等[28]。 2. 国内临床试验：姚鹏等[29]率先对30例失代偿肝硬化患者进行MSCs移植并随访12周，其中ALT、TBil逐渐下降以及Alb逐渐上升的人数均在20例以上，PTA全部呈不同程度升高，均未发现严重不良反应，王娟等[30]的研究也有类似结论；高志良等[31]报道32例CLF患者在术后1～4周的肝功能、凝血功能恢复较对照组为好，其中TBil、Alb和PTA分别在术后3、4周和2周与对照组存在显著差异。潘兴南等[32]对24例失代偿肝硬化及肝衰竭患者的临床试验显示术后4周开始出现肝功能显著改善，术后8周凝血功能显著好转，术后12周有10例肝脏容积显著增大。另外国内还有一些临床研究也证实了MSCs移植治疗失代偿肝硬化的可行性和安全性[33]。然而，国内关于CD34+/HSCs移植报道较少，王迪等[34]观察40例接受以CD34+为主的失代偿肝硬化患者并随访8周，发现凝血功能及大多数肝功能指标在术后4周也均有显著改善。此外，MSCs治疗重型肝炎的临床对照试验也已开展不少。 四、挑战与展望 近年，虽然有些研究对BMSCs治疗CLF的有效性提出质疑，但大多数研究结果还是令人鼓舞的，当前BMSCs治疗面临以下挑战：（1）亟待完善BMSCs亚群的标准分类，（2）加强肝内微环境，尤其是旁分泌机制的研究，探索发现BMSCs归巢、转化等方面的重要化学因子和信号传导通路，（3）开展大样本、长时间、随机化对照的临床研究，为BMSCs移植提供最佳亚群、细胞数以及临床经验。随着细胞分子生物学等前沿技术的不断发展，BMSCs治疗存在很大的提高和完善空间，它必将对未来医学发展带来一次深远革命，成为治疗包括CLF在内的器官功能衰竭的重要手段。 参 考 文 献 [1]Cho KA, Ju SY, Cho SJ, et al. 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