【摘要】目的 观察热卡限制对高脂饲养大鼠肝脏Forkhead转录因子O1（FoxO1）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-P）mRNA表达的影响，探讨其可能机制。 方法 24只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（7只）、高脂组（9只）和热卡限制组（8只），分别给予正常饮食、高脂饮食和60%热卡限制饮食，共饲养12周。实验终点时取空腹血测血糖、胰岛素、甘油三酯和总胆固醇；称内脏脂肪重量及体重，计算内脏脂肪重量占体重百分比；逆转录聚合酶链法检测肝脏FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA表达变化；光镜观察肝脏组织学改变。 结果 高脂饮食大鼠出现明显腹型肥胖，空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯和总胆固醇均升高，FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA表达较正常组分别增加18.9%、33.8%和24.6%（P值均＜0.01），且光镜下出现肝脏脂肪变性；热卡限制后大鼠体重、内脏脂肪含量显著下降，空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、总胆固醇均有所下降，FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA表达较正常组分别减少26.6%、35.0%和34.3%（P值均＜0.01），同时镜下脂肪变性有所好转。 结论 热卡限制能有效降低FoxO1、PEPCK和G-6-P基因表达，增强胰岛素信号传导，抑制肝脏糖异生，调节糖代谢。 【关键词】糖原异生； 高脂饮食； 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶； 葡萄糖-6-磷酸酶； 热卡限制 The effect of calorie restriction on the expression of liver抯 gluconeogenesis genes of rats fed a high fat diet LUO Ming-juan, CHEN Lu-lu, ZHENG Juan, ZENG Tian-shu, DENG Xiu-ling. Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Corresponding author: CHEN Lu-lu, Email: cheria_chen@ 126.com 【Abstract】Objective To observe the effect of calorie restriction on the high fat diet rats mRNA expressions of liver forkhead box O1(FoxO1), phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), glucose-6-phosphatase (G-6-P) and to explore the possible mechanisms. Methods 24 normal 6-week-old male Wistar rats were randomly divided into three groups: normal chow group (NC, n = 7), high fat diet group (HF, n = 9) and calorie restriction group (CR, n = 8). They were fed for 12 weeks. At the end of the experiment, the rats were sacrificed and their fasting blood glucose (FBG), insulin (INS), triglycerides (TG), total cholesterol (TC) were measured. Their visceral fat (VF) and body weight (BW) were also measured and VF/BW was calculated. Gene expression was investigated by using semi-quantitative RT-PCR methods. Liver histology was studied with HE stained slides. Results Compared with the NC group, HF group rats developed visceral obesity which was accompanied by higher FBG, plasma INS, TG, and TC. The levels of FoxO1, PEPCK, and G-6-P increased by 18.9%, 33.8%, and 24.6%, respectively (P < 0.01). Liver steatosis was observed with microscopy. The BW, VF FBG, INS, TG and TC of the CR group rats were lower in comparison to those of the HF group. The levels of FoxO1, PEPCK and G-6-P were lower by 26.6%, 35.0%, 34.3% (P < 0.01). Meanwhile, liver steatosis was also milder. Conclusion Calorie restriction can inhibit the expressions of FoxO1, PEPCK and G-6-P, strengthen insulin signal conduction, suppress gluconeogenesis and thus regulate glycometabolism. 【Key words】Gluconeogenesis; High fat diet; Phosphoenolpyruvate carboxykinase; Glucose 6 phophate; Calorie restriction 长期高脂饮食造成明显的腹型肥胖和空腹血糖升高主要由糖异生增加造成。糖异生的代谢受其关键酶如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose 6 phophate，G-6-P）的调控。Forkhead转录因子O1（forkhead box O1，FoxO1）对PEPCK和G-6-P具有激活作用，在糖尿病db/db小鼠中，肝脏FoxO1的表达升高，而在高脂饲养的大鼠中有、无FoxO1 mRNA表达的改变尚不清楚。热卡限制能有效降低血糖，其机制是否与FoxO1水平有关尚不明了。本研究旨在观察不同饮食情况下大鼠肝脏FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA的表达以及限制饮食对上述基因的影响。 材料与方法 1．动物及饲料：普通级雄性Wistar大鼠24只，6周龄，体重140～180g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。正常饲料购自湖北省实验动物中心，含热能12.93kJ/g，按照热量百分比计算，蛋白质占31.7%，脂肪占18.9%，碳水化合物占49.4%。高脂饲料在正常饲料基础上，按质量百分比添加20.0%熟猪油、10.0%蔗糖和0.1%胆盐。成型后的高脂饲料中各营养成分的热量百分比为：蛋白质15.7%，脂肪50.6%，碳水化合物33.7%。 2. 动物分组和模型制备：大鼠适应性饲养1周后随机分为实验组和对照组，实验组17只，高脂饮食饲养；对照组7只，正常饮食饲养。8周后，对照组大鼠继续予以正常饮食饲养，实验组大鼠随机分为高脂组和热卡限制组。高脂组9只，继续高脂饮食饲养；热卡限制组8只，60%热卡限制饮食饲养。大鼠均自由进水。饲养室内温度为（21±1）℃，相对湿度60%±10%，光照时间12h/d（8时～20时）。4周后实验结束。 3. 标本的收集与处理：入选时（0周）取尾静脉血测定血糖。实验结束时（12周）大鼠禁食12h，取动脉血测定空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯和总胆固醇。次日称体重，腹腔注射乌拉坦麻醉，迅速取肝脏及副睾、肠系膜和肾周的脂肪。肝脏一部分用等渗盐水清洗后置于-80℃冰箱冻存；一部分4%甲醛固定，石蜡包埋，常规切片。脂肪称重，计为内脏脂肪含量，并计算内脏脂肪重量占体重百分比。 4. 生物化学指标测定：血糖检测用葡萄糖氧化酶法，试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司。血甘油三酯和胆固醇用日本Olympus公司AU2700型全自动生物化学分析仪检测。血胰岛素用放射免疫法检测，试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司。 5. 肝脏组织病理学变化：肝脏组织切片HE染色，光镜下观察形态学变化。 6. mRNA表达量检测：Trizol提取总RNA，各取5μl RNA进行逆转录，再分别取2μl cDNA进行聚合酶链反应。根据GenBank设计引物，Foxo1上、下游引物序列分别为5′-GCATCCATGGA CAACAACAG-3′和5′-TGATGGTGCTAGC GTTTGAG-3′，产物长211bp；PEPCK上、下游引物序列分别为5′-CGCTGGATGTCAGAAGAG G-3′和5′-CAGTGAGTTCCCACCGTAT-3′，产物长378bp；G-6-P上、下游引物序列分别为5′-TCCACCTTGACACTACACCC-3′和5′-CA GCATTCACGCTTTCCT-3′，产物长511 bp；β-肌动蛋白上、下游引物序列分别为5′-CTATCGGC AATGAGCGGTTC-3′和5′-CTTAGGAGT TGGGGGTGGCT-3′，产物长762bp。反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30～45s，53～60℃ 30～45s，72℃ 40～50s，30～38个循环；72℃ 7min。各基因退火温度和循环次数分别为：FoxO1 60℃，36个循环；PEPCK 53℃，38个循环；G-6-P 58℃，38个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，紫外凝胶成像系统分析吸光度值，以β-肌动蛋白为内参照，计算待测基因mRNA相对表达量。 7．统计学处理：应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差表示。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 1．不同饮食对血脂、血糖、体重和内脏脂肪含量的影响：实验结束时高脂组出现明显的脂质代谢紊乱，与正常对照组相比，空腹胰岛素、甘油三酯和总胆固醇分别增加了123%、85%和101%，差异有统计学意义（t值分别为5.76，7.74和8.50，P值均＜0.01）。高脂组大鼠空腹血糖较正常对照组增加了40.4%，差异有统计学意义（t＝3.05，P＜0.01）。高脂组与正常组体重差异无统计学意义（t＝1.79，P＞0.05），而内脏脂肪含量和内脏脂肪含量/体重较正常对照组分别增加了68.19%和82.81%，差异有统计学意义（t值分别为3.87和4.32，P值均＜0.01）。热卡限制后，血脂水平下降，热卡限制组与高脂组相比，空腹胰岛素、甘油三酯和总胆固醇分别下降了72%、59%和67%，差异有统计学意义（t值分别为7.75，11.67和13.95，P值均＜0.01）；同时，空腹血糖明显下降，较高脂组降低了39.5%，差异有统计学意义（t＝4.26，P＜0.01）。体重、内脏脂肪含量和内脏脂肪含量/体重较高脂组分别下降24.48%、83.41%和77.97%，差异均有统计学意义（t值分别为6.98，8.34和7.70，P值均＜0.01）。见表1，2。 2．肝脏形态学变化：光镜下，正常组肝细胞索排列正常，核圆、大、居中、无脂滴；高脂组大鼠肝细胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，呈严重的脂肪变性；热卡限食组大鼠肝组织脂肪变程度明显减轻（图1）。 3．各组大鼠基因mRNA表达的改变：高脂组大鼠肝脏FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA较正常组分别增加18.9%、33.8%和24.6%，差异有统计学意义（t值分别为2.70，3.60和2.71，P值均＜0.01）；热卡限制组大鼠肝脏FoxO1、PEPCK、和G-6-P mRNA较高脂组分别下降26.6%、35.0%和34.3%，差异有统计学意义（t值分别为5.14，5.87和5.75，P值均＜0.01）。见图2。 讨 论 长期高脂饮食会造成明显的腹型肥胖，内脏脂肪的分解活性增加，运送到肝脏的有机脂肪酸增加，最终导致肝脏胰岛素抵抗[1]。肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能力下降。肝脏葡萄糖输出由糖异生和糖原分解两部分组成[2]。赵文惠等[2]研究表明高脂饮食饲养的大鼠空腹血糖升高的主要原因是糖异生。Kabir等[3]用高脂饲料喂养犬，12周后发现糖异生关键酶PEPCK和G-6-P的表达增加。肝脏胰岛素的敏感性与内脏脂肪含量呈负相关，内脏脂肪含量已成为肝脏胰岛素敏感性的一个主要决定因素[4]。本实验中高脂组大鼠内脏脂肪含量较正常组明显增加，肝脏HE染色可以看到高脂组呈现明显的脂肪变性，说明出现了典型腹型肥胖。同时，空腹血糖、血脂、胰岛素也较正常组升高，出现了糖、脂代谢紊乱，胰岛素的敏感性下降。糖异生关键酶PEPCK和G-6-P表达增加，导致肝糖输出增加，这些均与文献报道一致[1-4]。 FoxO1是转录调节因子，也是胰岛素/胰岛素样生长因子1通路中的关键分子，其上游受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B磷酸化级联通路的调节，下游调节的靶基因多与细胞周期、细胞凋亡、衰老及代谢有关。当胰岛素/胰岛素样生长因子1与受体结合后，激活磷酸肌醇-3激酶/PIP3依赖的蛋白激酶/蛋白激酶B磷酸化级联通路，活化的蛋白激酶B使FoxO1苏氨酸和丝氨酸发生磷酸化，导致FoxO1发生核转位，由核内转运到胞质中，导致FoxO1的转录失活，抑制靶基因的表达[5]。FoxO1与糖异生基因启动子直接结合，激活葡萄糖的产生，在糖异生过程中起着重要的作用[6]。肝脏是FoxO1基因的主要表达部位，在糖尿病db/db小鼠中，肝脏FoxO1 mRNA的表达增高，FoxO1蛋白的表达也增加。FoxO1-△256是FoxO1的突变体，可干扰FoxO1的功能。通过腺病毒介导的基因转染技术将FoxO1-△256转染到小鼠肝脏中，其糖异生基因PEPCK和G-6-P的表达显著降低[7]。本研究结果表明在高脂饮食喂养的大鼠中，已经有肝脏FoxO1 mRNA表达的增加，同时糖异生关键酶PEPCK和G-6-P mRNA表达也增加。 热卡限制能延长实验动物（包括大鼠、小鼠和恒河猴）的寿命，改善动物模型中的胰岛素抵抗。Park等[8]研究证实热卡限制改善了OLETF大鼠的胰岛素抵抗，其可能与增加了大鼠脂肪组织中葡萄糖转运蛋白4的表达有关。Barzilai等[4]研究表明热卡限制能够有效减轻体重，尤其是内脏脂肪的含量，从而改善胰岛素的敏感性，改善糖代谢。限食后，本研究中大鼠体重、内脏脂肪含量均明显减轻，血糖、血脂和血胰岛素均下降，肝脏HE染色显示肝脏脂肪变明显减轻，说明限食的确有效降低了血糖，改善了肝脏胰岛素敏感性，与Barzilai等[4]报道一致。同时，FoxO1、PEPCK和G-6-P mRNA表达均降低。由此推断限食降低血糖的机制可能在于增强了胰岛素信号传导，促进FoxO1转录失活，从而使其靶基因PEPCK和G-6-P的表达也减少，抑制肝脏糖异生，调节糖代谢。 参 考 文 献 [1]Mittelman SD, Van Citters GW, Kirkman EL, et al. Extreme insulin resistance of the central adipose depot in vivo. Diabetes, 2002, 51: 755-761. [2]Zhao WH, Xiao JZ, Yang WY, et al. Relationship between hepatic insulin resistance and the expression of genes involved in hepatic glucose output. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 45-48. (in Chinese) 赵文惠,萧建中,杨文英,等.肝脏胰岛素抵抗与肝糖输出调控基因表达的关系.中华肝脏病杂志,2006,14:45-48. [3]Kabir M, Catalano KJ, Ananthnarayan S, et al. Molecular evidence supporting the portal theory: a causative link between visceral adiposity and hepatic insulin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 288: E454-461. [4]Barzilai N, Banerjee S, Hawkins M, et al. Caloric restriction reverses hepatic insulin resistance in aging rats by decreasing visceral fat. J Clin Invest, 1998, 101: 1353-1361. [5]Li XB, Xie Z, Shi FX. FOXO in the regulation of differentiation, proliferation, immunity and aging of cells. Zhongguo Linchuang Kangfu, 2006, 10: 158-162. 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