根据乙型肝炎病毒（HBV）全基因组序列差异≥8%或S基因序列≥4%，可将HBV分为A～H 8个基因型。不同基因型的产生反映了HBV变异进化的特点。目前有很多研究显示，HBV基因型与病情轻重有较密切的关系。本研究用S基因序列测定法对天津地区223例HBV DNA阳性的乙型肝炎患者进行基因分型，并分析其与临床的相关性。 材料和方法 一、血清标本 选取乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性和HBV DNA阳性的乙型肝炎患者血清223份，其中男173例，女50例，年龄2～72岁。按2000年《病毒性肝炎防治方案》标准［1］诊断为急性乙型肝炎15例，慢性乙型肝炎135例，肝硬化23例，原发性肝癌11例，无症状HBsAg携带者39例。 二、血清HBV标志物检测 HBsAg、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc检测应用ELISA法，HBeAg和抗-HBe均阴性者再采用电化学发光免疫检测法进行检测（酶联免疫试剂由华美生物制品有限公司提供，电化学发光试剂由罗氏公司提供）。HBV DNA用荧光定量PCR法检测（试剂购自中山大学达安公司)，HBV DNA正常上限值＜1×103 拷贝/ml。 三、HBV基因型的测定 采用HBV S基因序列分析方法检测： (一) 血清HBV DNA提取及聚合酶链反应（PCR） 50 μl血清加150 μl蛋白酶K裂解液（10 mmol/L Tris HCl pH 8.0，5 mmol/L EDTA pH 8.0，0.5 % SDS，200 μg/ml 蛋白酶K），55℃裂解2 h后酚/氯仿抽取，乙醇沉淀，沉淀溶于10 μl H2O作为HBV DNA模板。PCR反应体系为50 μl含HBV DNA模板10 μl，10×PCR缓冲液，MgCl2 2 mmol/L，上游引物（S1 nt203221，5′GCGGGGTTTTTCTTGTTGA3′）0.5 μmol/L，下游引物（S2 nt788769，5′GGGACTCAAGATGTTGTACAG3′） 0.5 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶2U（美国Gibco公司）。扩增条件为94 预变性5 min，后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，共35个循环，最后72℃ 延伸5 min。取4 μl PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增产物长度为585 bp。 (二) PCR产物直接测序 采用美国Millipore高纯度PCR产物试剂盒将PCR产物纯化，以PCR引物S1为直接测序引物，用加拿大VISIBLE GENETICS公司的Opengene automated DNA sequencing system I，Version 3.0测序仪进行测序。 (三) 基因型测定 根据GeneBank发表的人类HBV基因序列，用NCBI服务器中的BLAST进行同源性检索以确定A～H 8个标准HBV基因序列。将测得的HBV S区基因序列输入DNAstar分析软件中，与GeneBank中 HBV S基因标准序列进行同源性比较，所测片段的序列与标准序列的异源性<4%，归为同一基因型。 四、统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件，多个计量资料比较采用方差分析，样本率的检验采用χ2检验。 结果 一、HBV基因型检测 结果显示，223例HBV感染者中，B基因型有41例（18.39%），C基因型有174例（78.03%），BC混合基因型有7例（3.14%），D基因型有1例（0.45%）。1例D基因型患者为男性，42岁，HBeAg阳性，HBV DNA为4.3×104拷贝/ml，临床诊断为慢性乙型肝炎。 二、B、C和BC基因型HBV感染者的一般临床资料比较（见表1） 表1 （略） 三、 B、C和BC基因型HBV感染者血清HBV标志物的比较（见表2） 表2（略） 先采用ELISA法检测血清HBV标志物，223例HBV感染者HBeAg阳性103例，抗-HBe阳性88例， HBeAg和抗-HBe均阴性32例，再采用电化学发光免疫检测法对此32份血清进行检测，结果显示HBeAg阳性者19例，抗-HBe阳性者13例。 四、 B、C和BC混合基因型HBV感染者临床诊断类型构成情况（见表3） 表3（略） 讨论 HBV基因型最显著的特征之一是呈一定的地理区域性分布。在我国HBV基因型主要以B 型和C型为主，也存在D型及BC混合型，其中北方地区以C型多见，而南方多见B 型。本研究显示，天津地区HBV感染存在C型、B型、BC混合型及D型，其中C型为优势基因型（占78.03%），其次为B型（占18.39%）， BC混合型仅占3.14%，也有1例D型（占0.45%），未发现其他基因型。本组资料中各基因型之间的性别构成比无明显差异（P>0.05），但BC混合型的年龄明显大于B型和C型，且差异有显著性（P<0.01）。混合基因型的存在可能有两方面原因。首先是在长期的病程中重复感染不同基因型病毒株所致；其次在长期感染状态下，HBV为逃避机体的免疫压力而发生变异，变异逐渐积累而产生新的基因型。这些都是在长期感染状态下发生的，因此推测感染混合型的患者年龄可能偏大，这与本研究BC混合型年龄明显大于B型和C型的结果相符。 目前有许多研究提出，不同的基因型与血清HBeAg转换、HBV载量、ALT及TBIL等指标有一定相关性。本研究结果显示，不同基因型之间的HBeAg和抗-HBe阳性率差异无显著性，血清HBV DNA水平的差异亦无显著性。由于大多数研究仅观察患者某一时刻的相关指标与基因型的相关性，可能会导致结果的偏差，这也可能是目前对于基因型与血清HBV标志物及与疾病活动性的关系存有争议的原因。 本研究结果表明，不同基因型之间临床诊断类型的构成是不同的，其中C型和BC混合型分别与B型比较差异有显著性。B基因型中无症状携带者的比例明显高于C型和BC混合型，而C型和BC型中肝硬化和肝癌的比例明显升高，以BC混合型最高。国内外有多篇报道显示，C基因型较B型更易发展为肝硬化和肝癌［24］，本组资料结果与之一致。BC混合型中肝硬化和肝癌的比例最高，考虑与此组患者年龄明显偏大，进展至肝硬化或肝癌的几率明显增加有关。 参考文献 1中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 肝脏，2000，5∶257-263. 2Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Genotypes and clinical phenotypes of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Clin Microbiol, 2002, 40∶1207-1209. 3许军, 王齐欣. 乙型肝炎病毒基因型与病情轻重的关系. 中华肝脏病杂志, 2003, 11∶1113. 4李雅娟, 庄辉, 李杰,等.乙型肝炎病毒感染者病毒基因型和亚型分布及其临床意义. 中华肝脏病杂志, 2005, 13∶724-729. 上海《肝脏》杂志社版权 |