【关键词】 癌，肝细胞； 基因疗法； 组织疗法 Selection and optimization of transport vehicles for hepatocellular carcinoma targeted gene therapy XU Zeng-hui, QIAN Qi-jun. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Gene therapy; Tissue therapy 【First author's address】 Laboratory of Gene and Viral Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China Corresponding author: QIAN Qi-jun, Email: qianqj@163.com 肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增原发性肝癌患者25万例。我国是肝癌的高发区，目前患者数约占全球的55%，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌。临床上肝癌治疗以手术为主，然而肝癌发病者大多数已处于晚期，常伴随肝内外多处转移，不适合手术。常规的化疗、放疗、介入等方法也只是辅助治疗，且会对患者造成较大身心伤害。分子靶向药物如索拉非尼等对晚期肝癌患者也仅能延长2个月左右的生存期，且不良反应较大。肝癌基因治疗作为一种极具前景的治疗方案备受世界各国关注。随着肝癌基因治疗近30年的发展，其对肝癌的治疗已经取得了初步的成功，本文将结合自身工作就肝癌基因治疗中靶向载体的选择及其优化策略作一简短探讨。 一、肝癌基因治疗存在的问题 基因治疗是直接在基因水平上对疾病进行治疗，包括对缺陷基因的补偿、修复、抑制或上调表达等多种方式。当前肝癌基因治疗在临床研究中主要通过非病毒载体、增殖/非增殖病毒载体、细胞载体等运输载体将治疗基因如p53、白细胞介素（IL）等导入人体发挥治疗作用，取得了一定的效果。然而，目前所有肝癌基因治疗相关的临床试验中没有一个治疗载体可以特异性转染肝癌细胞，也会感染其他非肿瘤细胞，尤其是CD68+巨噬细胞。在一项I期临床试验中，携带p53基因的非增殖腺病毒（SCH-58500）肝内动脉注射后主要转染肝实质组织，导致对肿瘤转染的阻碍[1]。这种阻碍可能是因为正常肝组织中大量表达腺病毒受体(CAR，5型腺病毒感染细胞的主要受体），导致大多数腺病毒感染了正常肝组织而对肿瘤组织的感染相对很少。然而，由于某些肿瘤组织中也高表达CAR受体，理论上也可以介导腺病毒的感染，但是也没有发现腺病毒对该肿瘤组织的高感染，所以，低水平的肿瘤转染效率还可能是因为血-瘤屏障（hemato-tumoral barrier）。另一项临床试验的体内成像数据显示，病毒剂量和基因表达量并不成正比例。腺病毒肝动脉注射后可感染肿瘤，但是这种感染效率很低，即使反复注射，其基因表达情况也无法检测到。我们的研究结果表明，这一方面是因为体内存在腺病毒的中和抗体，另一方面主要是因为在腺病毒复制过程中产生大量的纤毛封闭了周围细胞上腺病毒的结合位点，阻碍了其进一步感染[2]。 另一个问题是治疗基因表达时间短。在临床试验中发现，肿瘤内注射腺病毒2～8 d后即可检测到肿瘤细胞被病毒转染，然而体内转基因的表达却很短暂，体内成像显示病毒载体注射9 d后胸苷激酶(TK)基因已无表达[3]。腺病毒携带IL-12基因瘤内注射，10 d后PCR即检测不到IL-12基因。溶瘤疱疹病毒（NV-1020）经肝内动脉注射后在肝脏内快速被清除[4]。转基因检测不到，可能是因为前体药物介导细胞死亡或者免疫细胞介导细胞死亡或者转基因沉默，以及可能是这些因素的相互作用。 二、肝癌基因治疗载体的优化策略 从现有的研究中不难看出，当前肝癌基因治疗中主要存在的问题有：目的基因表达时间短、运输载体容易被清除、靶向性不够，导致整体疗效不佳。另外，例如在转导p53基因治疗肿瘤时，理论上p53基因仅能转入有限数量的肿瘤细胞内（我们不能期望转运载体能够转染每一个肿瘤细胞），因此，单靠p53的促凋亡作用是无法治愈肿瘤的。然而，实际研究中发现部分患者也能取得较好的疗效，这可能是因为p53还触发了人体免疫机制等其他作用。因而，要想获得比较好的疗效，我们一方面需要采用分泌型蛋白，并能够激发免疫反应，或者借助溶瘤病毒的增殖作用再次感染周围细胞；另一方面，通过改造病毒外壳，使其具有更强的靶向感染能力，尤其是增强对肿瘤干细胞的感染。下面我们将进一步讨论载体优化的策略。 1. 靶基因的选择：多年以来，人们对肝癌进行了大量研究，也尝试了多种治疗方式。然而，只有少数候选治疗基因进行到了临床试验阶段，包括抑癌基因p53、自杀基因疱疹病毒-1-胸苷激酶（HSV-1-TK)和硝基还原酶NTR[1,5-7]；以及细胞因子基因IL-12、免疫抗原基因人类白细胞抗原-B7、免疫刺激因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等[8-10]。 在一项II期临床试验中非增殖腺病毒携带p53基因经肝动脉注射并联合5-氟尿嘧啶治疗肝癌，结果显示对肝癌具有一定的疗效[11]。在另一项临床试验中，晚期肝癌患者在肝移植后接受注射携带HSV-1-TK基因的非增殖腺病毒载体进行治疗，也显示了初步的疗效[12]。再有，溶瘤痘病毒JK-594携带人GM-CSF基因，该病毒载体对于表皮生长因子受体-Ras信号通路激活以及对干扰素信号通路异常的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，GM-CSF的表达可促使部分患者的嗜中性粒细胞增加，显示出一定的抗肿瘤效应[10]。在治疗基因的选择上，一方面需要根据肿瘤的致病机制来选择合适的基因，另一方面需要选择那些能够分泌到胞外或者能刺激机体针对肿瘤的免疫反应的候选基因，从实验研究和临床研究都可以看出这样的基因会获得更好的疗效。 2.启动子的筛选：用肿瘤特异性或广谱启动子可将载体基因的表达限制在目的肿瘤细胞中，有利于治疗基因在局部富集至有效浓度，避免对正常组织造成损伤。广谱性启动子如人端粒酶逆转录酶启动子、缺氧反应启动子等，我们研发的肿瘤特异性增殖腺病毒SG600-P53，用人端粒酶逆转录酶启动子及缺氧反应启动子分别调控腺病毒的E1A及E1B基因，从而使病毒的复制更准确地靶向肿瘤细胞[13]。肿瘤特异性启动子，如肝癌的甲胎蛋白（AFP）启动子。最近Foka等[14]用基因芯片对肝癌组织标本和正常组织进行了比较分析，筛选出细胞色素P450、阿朴脂蛋白B等8个肝癌特异性启动子，并用HSV-1进行治疗获得了较好的效果。对于这些肝癌特异性启动子仍需进行多方验证才能进一步应用到肝癌基因治疗中去。 3.外壳改造：通过改造病毒外壳结构，可增强病毒载体对肿瘤细胞乃至肿瘤干细胞的靶向性以及减少机体针对病毒本身的免疫反应。针对腺相关病毒和腺病毒的改造有较多的研究报道。AAV8对肝脏细胞具有很强的感染效率，Kota等[15]用AAV8携带小干扰RNA在小鼠模型中对肝癌产生特异性杀伤作用而无不良反应。Asokan等[16]通过嵌合AAV2和AAV8表面结构域，产生的AAV2i8病毒改变了其原有的抗原特性，很容易穿越血管屏障，选择性地高效感染心肌细胞和全身骨骼肌细胞，而对肝脏细胞几乎不感染。AAV2i8既克服了AAV2在临床应用时的免疫排斥反应又增强了其对骨骼肌细胞的特异性，因而对于骨骼肌疾病的靶向治疗具有重要意义。理论上，我们可以用类似的方法使AAV病毒特异性地靶向肝癌细胞，不过这方面研究仍待继续深入。 针对腺病毒外壳的改造方面，为进一步提高对肿瘤细胞（尤其是对肿瘤干细胞）的感染效率，我们实验室建立了大容量腺病毒外壳改造文库，以寻找到更为有效的新型腺病毒系统。嵌合型双调控增殖腺病毒系统CNHK600-F35和CNHK600-F11（在Ad5病毒载体上分别嵌合35型和11 b型腺病毒的Fiber）的抗肿瘤疗效及安全性较之前的系统有明显提高，且能够更好地靶向肿瘤干细胞。最近, Jiang等[17]发现溶瘤腺病毒Delta-24-RGD 能够有效地清除脑癌干细胞。Clement等[18]使用慢病毒为载体介导小干扰RNA以抑制胶质瘤细胞的SHH通路活性, 结果表明富含肿瘤干细胞的CD133+细胞在NOD/SCID 小鼠体内的成瘤能力明显减弱。 4.基因-溶瘤病毒：早期基因治疗的病毒载体只是运输工具，事实上一些病毒本身就具有通过自身的增殖而裂解肿瘤细胞的作用。如果将这种特性加以应用，就可实现基因-病毒双重治疗作用。我们是最早提出基因-病毒治疗策略的实验室之一，从1998年开始逐步建立了CNHK200（腺病毒E1B-55KD缺失的增殖病毒）、人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒E1A 的CNHK300、双调控的增殖病毒CNHK500（分别用人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子调控腺病毒的E1A及E1B基因）以及嵌合型双调控腺病毒载体CNHK600（在CNHK500基础上对E1A区的24个碱基进行突变)[19-22]。其中基于CNHK600系统的SG600-P53已完成临床前所有实验研究[13, 23-24]；申报并获批了相关专利，目前正等待国家食品药品监督管理局的临床批文。 另外，如嵌合型溶瘤腺病毒2/5（又名ONYX-015）、溶瘤HSV-1病毒NV-1020（又名Catherex）、呼吸道肠道过滤性病毒（reovirus）、水泡状口炎病毒（VSV）等都具有对肿瘤的特异性溶瘤作用。电子显微镜提供确凿的证据表明溶瘤腺病毒在肝癌患者体内发生增殖。同样，溶瘤痘病毒JX-594在瘤体内注射的临床试验结果也表明溶瘤痘病毒在体内可复制[10]。这些证据证明了溶瘤病毒在体内确实通过溶瘤作用发挥了抗肿瘤的作用。 5.细胞载体：溶瘤病毒介导的肝癌基因病毒治疗通过直接溶解、细胞凋亡、自噬、诱导抗肿瘤免疫等多种机制发挥抗瘤作用，但从现有的基础和临床研究数据看出病毒载体存在容易被补体蛋白中和、被网状内皮系统清除、被抗体中和、表达时间不够、特异性不强等缺陷。肿瘤抗原特异性T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK)、间充质干细胞等细胞对肿瘤组织有靶向趋化作用，在肿瘤分泌出的趋化因子等作用下而迁移到肿瘤局部，对肿瘤具有特异/非特异的杀伤作用[25-27]。此类细胞可作为溶瘤病毒的“特洛伊木马”安全护送病毒载体至肿瘤部位，且溶瘤病毒与这类细胞在体内可发挥协同治疗作用，既能逃避免疫清除，又能增强靶向性，还可延长表达时间。其他，例如同源性成纤维细胞或者肿瘤细胞表达IL-12、B7或者同时表达二者，可触发针对肿瘤的免疫反应[28]。自体树突状细胞经体外导入肿瘤抗原如AFP、细胞因子或共刺激分子后回输体内治疗，其中树突状细胞携带IL-12在动物模型中对肝癌和胃肠道癌具有很好的疗效[29]。此类细胞载体也存在一些问题，如细胞需在体外培养，由于操作原因不同批次的细胞和不同实验室的细胞会有较大差异，另外，临床试验时的质量控制也难统一。我们实验室在细胞治疗方面积累了较多经验，经相关部门批准正在开展两项肝癌患者的CIK免疫细胞治疗的临床试验。迄今，我们已经做了100多例肝癌患者的CIK临床治疗，结果显示肿瘤有明显消退现象，患者感觉良好，无不良反应。同时，我们前期也开展了多项溶瘤病毒携带IL、干扰素以及抗体等基因感染CIK、自然杀伤细胞和间充质干细胞的实验研究，现在已经开始开展CIK携带治疗基因的临床试验研究，都取得一定的效果。 三、展望 当前肝癌的基因治疗已经取得一定进展，现有的临床试验中多数为腺病毒载体。尽管目前的临床结果还不理想，病毒载体容易被清除、基因表达时间不够、肿瘤杀伤效果不强，但总体而言肝癌基因治疗是一个较为安全的有效治疗方案。未来腺相关病毒介导小干扰RNA等治疗方案将为肝癌基因治疗注入新的活力，也有较好前景。条件复制型基因-病毒治疗随着对病毒外壳的改造以及与免疫细胞的联合应用，将会产生更为安全有效的抗肿瘤作用。 参 考 文 献 [1]Atencio IA, Grace M, Bordens R, et al. 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